刘韶华，刘慧芳，李六林
（山西农业大学园艺学院，山西 太谷 030801）
梨树是世界范围内重要的果树之一，具有很高的经济价值[1]。由纳雪黑星菌（Venturia nashicolaTanak et Yamamota）引起梨黑星病（Pear Scab）是目前我国梨产区的主要病害之一[2]。梨黑星病主要危害叶片和果实，会造成叶片黄化和果实畸形，严重影响梨的产量与品质[3]。研究发现，黑星菌能够引起梨胞内Ca2+水平的上升，同时诱导钙感受器相关基因上调表达[4]。Ca2+作为第二信使，在植物信号传导中发挥重要作用，它与钙传感蛋白结合，将钙信号级联放大并向下游传递，进而调控植物的生长发育和逆境胁迫应答[5]。目前，植物中主要存在三大类钙传感器，包括钙调素和类钙调素蛋白（Calmodulin and Calmodulin-like protein，CaM and CaML）、钙依赖蛋白激酶（Calcium-Dependent Protein Kinase，CDPK）和类钙调磷酸酶B亚基蛋白（Calcineurin B-like protein，CBL）[6-8]。与其他钙传感器相比，CDPK是植物与部分原生生物特有的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可不依赖钙调素蛋白而直接与钙离子结合，并将钙信号转化为磷酸化信号，从而进一步启动下游信号传导过程[9]。
CDPK普遍存在于植物和部分原生生物中，并且在植物生长的诸多方面起关键作用，如植物的生长发育、激素调节和对逆境胁迫的应答反应[10-12]。典型的CDPK具有4个保守的蛋白结构，分别为N端可变域、激酶域、自抑制域和类钙调素结构域[13]。激酶域含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶序列，同源性较高，类钙调素结合域通常含有4个可直接与Ca2+结合的EF手型结构[14]。研究发现，外界环境刺激会造成胞质Ca2+浓度发生变化，瞬时激活CDPK活性，使底物蛋白磷酸化，CDPK与促分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）协同调控转录因子并激活防卫基因的表达，从而使植物产生特异性抗逆响应[15]。目前，研究人员已在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、烟草（Nicotiana tabacum）和毛白杨（Populus tomentosa）等植物中克隆得到多个CDPK基因，并对部分成员进行表达分析[16-18]。然而，有关梨CDPK基因的研究鲜见报道。LIU等[4]研究发现，黑星菌侵染会诱导抗病品种黄冠梨PbCDPK29基因上调表达，而在感病品种雪花中受病原菌诱导下调表达，推测其可能在梨抗黑星病中发挥作用，所以对PbCDPK29进行克隆和生物信息学分析，为进一步阐明该基因的功能奠定基础。
本研究通过克隆梨PbCDPK29基因，并对其蛋白特性、系统进化关系和启动子区域的顺式作用元件进行分析，旨在为进一步研究PbCDPK29基因的生物学功能和抗逆分子育种提供理论依据。
1.1 试验材料
以雪花梨（Pyrus bretschneideriRehd.‘Xuehua’）品种为试验材料，雪花梨自山西农业大学试验基地采样，选取植物叶片进行试验，液氮速冻后保存于-80℃冰箱备用。
大肠杆菌菌株DH5α购于上海生工生物公司；
从TaKaRa生物公司购买反转录试剂盒和pMD19-T克隆载体；
从杭州新景生物试剂开发有限公司购买DNA胶回收试剂盒；
试验中其他化学试剂均为国产分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 梨叶片总RNA提取及cDNA合成参考关玲等[19]从果树中提取RNA的方法，通过改良CTAB法提取梨叶片总RNA，经质量检测合格后，利用反转录试剂盒获得cDNA。
1.2.2PbCDPK29基因的克隆根据梨基因组数据库（http://gigadb.org/search/new?keyword=Py‐rus）下载PbCDPK29基因（Pbr017041.1）序列，利用Primer Premier 5.0软件对其保守序列设计引物（表1）。以反转录后得到的cDNA为模板，利用高保真酶Phanta进行PbCDPK29基因全长编码区扩增，反应体系如下：cDNA模板2μL，2×Phanta Master Mix 10μL，上下游引物各0.8μL，ddH2O 6.4μL。电泳检测扩增产物后，通过DNA胶回收试剂盒将该目的片段回收，并将其与pMD19-T载体（Ta‐KaRa）连接，随后转化DH5α感受态细胞，挑取白色菌落阳性产物送到上海生工生物公司进行测序。
表1 引物序列Tab.1 The sequences of the primers
1.2.3PbCDPK29基因生物信息学分析利用ProtParam程序预测蛋白质各项理化性质；
采用GPS-Lipid预测蛋白序列的N末端棕榈酰化和豆蔻酰化位点；
亚细胞定位分析通过PSORT程序进行；
运用SignalP 5.0程序进行蛋白质信号肽分析；
蛋白质二级结构通过SOPMA在线工具分析；
蛋白质三级结构通过Phyre 2进行分析[20]；
采用MEGA 7.0软件，选择邻接法（neighbour-joining，NJ）构建梨与其他物种CDPK的进化树；
利用DNAMAN 8.0软件将PbCDPK29与其他物种的CDPK蛋白序列进行多序列对比；
运用PlantCARE分析启动子序列的顺式作用元件。
1.2.4PbCDPK29基因的表达分析在树体健壮的雪花梨树上选取健康、无病斑的新梢叶片，用浓度为0.1 mmol/L的MeJA溶液进行叶面喷施处理，喷至叶面充分湿润为宜，对照为无菌水处理。每个处理重复3次，分别在处理后0、24、48、72、96、120 h取样，采用改良CTAB法提取叶片总RNA，以反转录后合成的cDNA为模板，采用试剂盒SYBR Pre‐mix Ex TaqⅡkit（Vazyme）进 行 实 时 荧 光 定 量PCR。利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，Actin引物的设计参考LIU等[4]的报道，荧光定量引物序列如表1所示。
对荧光值变化曲线和熔解曲线进行分析后，通过2-∆∆Ct方法计算PbCDPK29在不同处理时间的相对表达量[21]，并采用SPSS 26.0软件进行差异显著性分析（P<0.05），最后利用Excel 2016作图。
2.1 PbCDPK29基因的克隆
以雪花梨叶片cDNA为模板，利用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，结果显示，PbCDPK29的扩增产物条带在1 500 bp左右（图1）。回收纯化目的条带后，将其连接到克隆载体上，挑选单克隆进行菌落PCR，选择阳性菌测序，结果显示，PbCDPK29基因CDS序列全长为1 554 bp，编码517个氨基酸（图2），比对结果显示，其与梨基因组PbCDPK29（Pbr017041.1）参考蛋白序列相似度为99.81%。
图1 PbCDPK29基因PCR扩 增Fig.1 PCR amplification of PbCDPK29 gene
图2 PbCDPK29基因的核苷酸和氨基酸序列Fig.2 PbCDPK29 gene nucleotide and amino acid sequence
2.2 PbCDPK29基因生物信息学分析
2.2.1PbCDPK29基因序列分析利用Prot‐Param软件预测分析结果显示，PbCDPK29基因开放阅读框为1 554 bp，编码517个氨基酸，分子质量为58.26 ku，理 论 等 电 点（pI）为6.03，分 子 式 为C2584H4102N714O774S22，总原子数为8 196。不稳定系数为31.95（参数小于40是稳定蛋白），被归类为稳定蛋白。脂肪系数为85.20，总平均亲水系数为-0.430，预测该蛋白为亲水性蛋白。PbCDPK29蛋白由20种氨基酸组成，其中，赖氨酸（Lys，8.7%）、亮氨酸（Leu，8.5%）、谷氨酸（Glu，8.3%）、缬氨酸（Val，7.7%）、甘氨酸（Gly，7.5%）和天冬氨酸（Asp，7.2%）这6种氨基酸所占比例达到47.9%，而色氨酸（Trp）仅占1.0%。GPS-Lipid在线软件预测显示，PbCDPK29蛋白在N端包含棕榈酰化和豆蔻酰化位点。PSORT亚细胞定位预测结果显示，PbCDPK29蛋白主要定位在质膜上，可信度为85%。信号肽预测结果表明（图3），信号肽预测值为0.001 3，其他预测值为0.998 7，PbCDPK29蛋白不存在信号肽，初步断定其不是分泌型蛋白。
图3 PbCDPK29蛋白的信号肽预测分析Fig.3 The signal peptide prediction analysis of PbCDPK29 protein
2.2.2 PbCDPK29蛋白二、三级结构预测分析PbCDPK29蛋白的二级结构通过SOPMA在线工具进行预测，结果显示（图4），该蛋白以α-螺旋（Al‐pha helix）和无规则卷曲（Random coil）结构为主，分别占46.23%、35.20%，延伸链（Extended strand）和β-转角（Beta turn）结构分别占9.67%和8.90%。利用Phyre 2.0在线软件对PbCDPK29蛋白进行三级结构预测，结果显示（图5），PbCDPK29蛋白序列中435个氨基酸（序列总长度的84%）与已知3D结构的恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）钙依赖蛋白激酶CDPK2匹配度最高，可信度为100%。
图4 PbCDPK29蛋白的二级结构Fig.4 Secondary structure of PbCDPK29 protein
图5 PbCDPK29蛋白的三级结构Fig.5 Tertiary structure of PbCDPK29 protein
2.2.3 PbCDPK29蛋白的系统进化树分析在NCBI网站中对PbCDPK29蛋白序列进行同源性BLAST比对，利用MEGA 7.0软件构建系统进化树，结果显示（图6），PbCDPK29与其他物种的CDPK具有较高的相似性，与蔷薇科植物苹果（Ma⁃lus domestica，XP_008392224.1）、甜 樱 桃（Prunus avium，XP_021800127.1）、梅花（Prunus mume，XP_016651831.1）、桃（Prunus persica，XP_007204103.1）和扁桃（Prunus dulcis，XP_034223379.1）的相似度较高，分别为97%、88%、88%、88%和87%，亲缘关系较近，说明PbCDPK29具有较高的保守性。
图6 PbCDPK29与其他物种CDPK家族蛋白的系统进化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of PbCDPK29 and CDPK family proteins of other species
2.2.4 PbCDPK29同源蛋白的多序列比对分析利用DNAMAN 8.0软 件 将 苹 果MdCDPK32（XP_008392224.1）、甜樱桃PaCDPK8（XP_021800127.1）、梅 花PmCDPK8（XP_016651831.1）、桃PpCDPK8（XP_007204103.1）和扁桃PdCDPK8（XP_0342233 79.1）与PbCDPK29蛋白进行多序列比对分析，结果发现（图7），PbCDPK29蛋白与上述CDPK蛋白序列都具有CDPK家族的典型结构域，从N端到C端依次为可变结构域、激酶结构域、自抑制结构域和包含能促进Ca2+结合的EF手型结构的类钙调素结构域。通过箭头和横线标示出这4个结构域，其中可变结构域的起始序列为MGNCCVT，包含棕榈酰化和豆蔻酰化位点[22]，该区域由20～140个氨基酸组成，同源性极低且保守性较差；
激酶结构域也称催化域，由约300个氨基酸组成，包含起催化作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶序列，同源性较高且相对保守；
自抑制结构域也称连接域，由30个左右的氨基酸组成，起到连接激酶结构域与类钙调素结构域的作用，该区域保守性最高；
类钙调素结构域又称调控域，保守性很低，该区域包含4个可直接与Ca2+结合的EF手型结构，这是CDPK不依赖钙调素而直接与Ca2+结合的原因。结果表明，PbCDPK29具有CDPK家族蛋白典型的4个结构域，确定所克隆的PbCDPK29结构完整。
图7 PbCDPK29与其他物种CDPK蛋白的多序列比对Fig.7 Multiple sequence alignment of PbCDPK29 and CDPK proteins of other species
2.2.5PbCDPK29基因启动子元件预测分析利用PlantCARE分析PbCDPK29基因转录起始位点上游1 500 bp序列的顺式作用元件，结果显示（表2），PbCDPK29基因启动子区域含有CAAT-box和TATA-box基本启动子元件，还存在厌氧诱导所需元件ARE，光诱导响应元件GT1-motif，干旱胁迫响应元件MBS，生长素响应元件TGAelement，与胚乳表达有关的GCN4_motif元件，与分生组织表达有关的CAT-box元件，茉莉酸甲酯响应元件TGACG-motif和CGTCA-motif。
表2 PbCDPK29基因启动子顺式作用元件分析Tab.2 Analysis of cis-acting elements in the promoter regions of PbCDPK29 gene
2.3 外源MeJA处理对PbCDPK29基因表达的影响
通过qRT-PCR检测外源MeJA处理下雪花梨叶片PbCDPK29基因的表达量，结果表明（图8），与对照相比，PbCDPK29被诱导上调表达，且呈现先升后降的表达模式，在处理72 h时达到表达峰值，其相对表达量约为对照的2.35倍。PbCDPK29基因的表达受MeJA的诱导，因此，推测PbCDPK29基因可能参与茉莉酸信号途径。以上结果也表明，对PbCDPK29启动子区域顺式作用元件预测的结果准确性较高。
图8 外源MeJA处理后PbCDPK29相对表达量分析Fig.8 Relative expression analysis of PbCDPK29 gene af⁃ter exogenous MeJA treatment
CDPKs普遍存在于各种植物中，并参与植物生长发育和逆境胁迫应答反应[23]。目前，已从水稻、油菜和二穗短柄草等植物中克隆获得CDPK基因[24-26]，这些研究在草本植物中比较常见，关于木本植物CDPK的研究报道较少，多集中于杨树[27]和苹果[28]。本研究从雪花梨叶片中克隆得到PbCDPK29基因，对其进行进化树和多序列比对分析，结果显示，PbCDPK29蛋白与其他蔷薇科植物的CDPK蛋白序列具有较高的相似性，其中与苹果MdCDPK32蛋白的亲缘关系最近，说明该基因在进化过程中较为保守；
另外，PbCDPK29与已知的CDPK蛋白都存在N端可变域、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶域、自抑制域和包含EF手型结构的类钙调素域，符合CDPK家族典型的结构特征[13]，说明克隆的PbCDPK29属于钙依赖蛋白激酶家族基因。多数CDPKs的N端可变域包含棕榈酰化和豆蔻酰化位点，它们可能与膜定位有关[29]。ZHAO等[30]研究发现，同时含有棕榈酰化和豆蔻酰化位点的蒺藜苜蓿MtCDPKs定位在质膜上。本研究中，PbCDPK29蛋白包含棕榈酰化和豆蔻酰化位点，并且亚细胞定位预测发现，该蛋白主要定位于质膜上，暗示N末端酰化位点可能在PbCDPK蛋白的亚细胞定位中起关键作用。
基因启动子区域包含的顺式作用元件对下游基因表达具有重要影响，并且根据顺式作用元件可以初步判断该基因家族成员的基本功能[31]。本研究发现，PbCDPK29基因的启动子序列中包含茉莉酸响应元件，并且MeJA处理后，该基因的表达量显著上调，说明PbCDPK29可能参与茉莉酸信号途径，但其具体的参与过程还有待进一步研究。另外，PbCDPK29启动子区域存在调节胚乳和分生组织发育的相关元件，推测PbCDPK29可能参与调控植物胚乳和分生组织的发育，且调控机制可能与水稻种子中特异表达的一种CDPK类似[32]；
还存在干旱胁迫响应元件，表明PbCDPK29可能受到干旱胁迫的诱导。
本研究从雪花梨叶片中克隆出长度为1 554 bp的PbCDPK29基因，编码517个氨基酸，与同科植物苹果的相似度最高，该基因编码的蛋白质具有CDPK家 族典型的4个保守结 构 域，PbCDPK29基因启动子区域含有MeJA响应元件；
qRT-PCR分析发现，PbCDPK29基因受MeJA诱导上调表达。本研究首次从梨中克隆得到PbCDPK29基因，并推测外源MeJA可能通过诱导PbCDPK29表达，从而缓解黑星病菌对梨的侵染，但该基因对梨黑星病菌侵染的具体响应机制还需要进一步研究。