谢凯放，陈永华，张智磊
1 安徽中医药大学研究生院 安徽合肥 230038
2 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031
威尔逊病[1]（Wilson disease， WD）又称肝豆状核变性（hepatolenticular degeneration，HLD），是一种铜代谢障碍性疾病，同时也是一种常染色体隐性遗传疾病，现已明确[2]肝豆状核变性是由于铜转运ATP7B酶功能缺陷，导致铜蓝蛋白合成减少、铜排泄障碍，导致铜沉积于肝、脑、肾、角膜等脏器中，从而表现出进行性肝损害、锥体外系症状、精神症状、角膜K-F环等。肝豆状核变性[3-7]发病常在青少年期，是迄今为止少数几种可治疗的神经系统遗传病之一，目前西医治疗的目的主要是减少铜的摄入和促进铜排出，主要药物有二巯丙磺酸钠（sodium dimercaptosulphonate，DMPS）、二巯丁二酸钠（sodium dimercaptosuccinate，Na-DMS）等金属络合剂；
祖国医学[8]相关文献对WD缺乏明确记载，对其发病机制的认识迄今尚未统一。根据其临床表现可将其归为“颤证”“肝风”范畴，其病位为肝、脑，与脾、肾、胆相关，临床分型[9]主要有湿热内蕴型、痰瘀互结型、肝肾亏虚型、脾肾阳虚型。
肝豆汤[10]为安徽省神经病研究所杨任民教授首创，由黄芩、生大黄、黄连、绵萆薢、穿心莲、半枝莲六味中药组成，临床应用随证加减，其中[11]黄连、黄芩、生大黄清热化湿，绵萆薢、穿心莲、半枝莲清热解毒，诸药合用发挥疏肝利胆、清热化湿、排铜化浊的功效。二十余年来，众多的学者对肝豆汤的临床疗效进行了大量的临床研究，陶庄、汪美霞等[11-12]临床研究表明，肝豆汤能改善湿热内蕴型肝豆状核变性吞咽功能障碍症状及吞咽评价量表评分，且疗效显著，但是具体作用机制目前尚不明确。
近些年来，随着网络药理学的兴起，中药方剂的作用机制研究又有了新的方向，其可通过构建中药方剂与疾病间的“化学成分-共同靶点”网络，最终我们从微小的分子层面解释方剂与疾病之间的作用机制。因此，本研究通过网络药理学方法，探讨肝豆汤治疗威尔逊病病吞咽障碍的作用机制，希望为今后肝豆汤治疗威尔逊病吞咽障碍的临床试验研究提供理论支撑。
1 肝豆汤化学成分筛选及潜在靶点预测
通过TCMSP数据库（计算机系统生物学网站），分别以肝豆汤组成的中药的名称（穿心莲、半枝莲、黄连、生大黄（按大黄检索）、黄芩、绵萆薢）为关键词进行检索，以生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥ 30%，类药性（Drug Likeness，DL）≥ 0.18为限定条件，筛选出肝豆汤组成的有效化学成分及相对应的潜在靶点，利用Uniprot数据库，将所获潜在靶点名称进行基因名标准化，最后得到肝豆汤对应的基因靶点.
2 威尔逊病吞咽障碍相关的作用靶点收集
通过Genecard和OMIM数据库，以“dysphagia in wilson disease”为关键词进行检索。
3 共同靶点的筛选和“化学成分-共同靶点”网络图的构建
将肝豆汤的基因靶点和威尔逊病吞咽障碍的疾病靶点分别上传至Veen在线作图工具进行Veen分析后，得到其共同靶点的名称。
利用Cytoscape3.9.1软件构建肝豆汤与威尔逊病吞咽障碍之间的“化学成分-共同靶点”网络图，并筛选出其核心化学成分。
4 蛋白互作PPI网络构建及核心靶点筛选
将肝豆汤与威尔逊病吞咽障碍的共同靶点导入到String数据库中进行PPI分析，限定物种为Homo Sapiens，最低置信度设置为0.9，同时隐藏游离的点，构建PPI网络图，下载对应的tsv文件，将文件代入到R4.2.0中，制作条形图，并得出核心靶点。
5 GO生物功能和基因组KEGG通路富集分析
借助Metascape数据库进行GO生物功能和KEGG通路富集分析（选取条件为P＜0.01），并利用R4.2.0软件所获结果进行可视化，绘制出条形图及气泡图，结合富集分析结果，从生物功能和信号通路的角度分析肝豆汤干预威尔逊病吞咽障碍可能的作用机制。
1 肝豆汤化学成分筛选及潜在靶点预测结果
通过TCMSP数据库搜索得到肝豆汤的化学成分121个，其中黄芩36个、生大黄16个、黄连14个、绵萆薢2个、穿心莲24个、半枝莲29个，表1列出OB值排名前20位的有效化学成分，对应潜在靶点1807个，使用Uniprot数据库将所获潜在靶点名称进行基因名标准化，最后合并去重共得到肝豆汤的基因靶点764个。
表1 中药有效成分表
2 疾病相关靶点筛选结果
通过GeneCards、OMIM数据库，以“dysphagia in wilson disease”为关键词进行数据库检索得到其基因靶点，然后将得到的基因靶点合并去重，最后共得到与威尔逊病吞咽障碍相关的作用靶点3250个。
3 共同靶点筛选及“化学成分-共同靶点”网络构建结果
将764个肝豆汤的基因靶点和3250个威尔逊病吞咽障碍的疾病靶点分别上传至Veen在线作图工具分析后，共得到共同靶点68个（见图1）。
利用Cytoscape3.9.1软件构建肝豆汤与威尔逊病吞咽障碍之间的“化学成分-共同靶点”网络（见图2），结果显示，网络共包含120个节点及517条边，其中肝豆汤化学成分节点52个，交集靶点节点68个。最后以节点度值筛选得出槲皮素（quercetin）、汉黄岑素（wogonin）、木犀草素 （luteolin）为度值排名前3的化学成分，这3个成分在肝豆汤干预威尔逊病吞咽障碍中可能起着关键作用。
图1 肝豆汤成分基因靶点与威尔逊病吞咽障碍基因靶点Veen图
图2 肝豆汤化学成分与威尔逊病吞咽障碍间“化学成分-共同靶点”网络图
4 PPI网络构建及核心靶点筛选结果
将68个肝豆汤与威尔逊病吞咽障碍的共同靶点导入到String数据库中进行PPI分析，限定物种同样为Homo Sapiens，最低置信度设置为0.9，构建PPI网络，同时将网络中游离的2个点隐藏。结果显示，网络共包含66个节点及1356条边，构建PPI网络图，下载对应的tsv文件并将文件代入到R4.2.0中，将度值排名前30制作成条形图（见图4），得出ESR1、MYC、CASP3为度值排名前3的靶点，提示这3个靶点可能是肝豆汤干预威尔逊病吞咽障碍的核心靶点。
图4 肝豆汤干预威尔逊病吞咽障碍靶点图
5 GO生物功能富集和KEGG通路富集分析结果借助Metascape数据库进行GO生物功能富集分析，结果得到 GO 条目 91个（选取条件为P＜0.05），考虑到图像输出的完整性，选取中P值最小的前15个条目，利用R4.2.0软件制作成GO生物功能富集分析条形图及气泡图（见图5、图6）。结果显示，肝豆汤干预威尔逊病吞咽障碍GO生物功能主要富集在DNA结合转录因子结合（DNA-binding transcription factor binding）、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合（RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding）、泛素样蛋白连接酶结合（Ubiquitin-like protein ligase binding）、泛素蛋白连接酶结合（泛素蛋白连接酶结合）、激酶调节活性（kinase regulator activity）；
借助Metascape数据库进行KEGG通路富集分析，结果得到KEGG条目118个（选取条件为P＜0.05），选取中P值最小的前21个条目，利用R4.2.0软件制作成KEGG通路富集分析条形图及气泡图（见图7、图8）。结果显示，肝豆汤干预威尔逊病吞咽障碍的信号通路主要富集在化学致癌-受体激活信号通路（Chemical carcinogenesis-receptor activation）、脂质与动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶通路（PI3K-Akt signaling pathway）、肝细胞癌通路（Hepatocellular carcinoma）等。
图5 肝豆汤干预威尔逊病吞咽障碍GO富集分析条形图
图6 肝豆汤干预威尔逊病吞咽障碍GO富集分析气泡图
图7 肝豆汤干预威尔逊病吞咽障碍KEGG通路富集分析条形图
图8 肝豆汤干预威尔逊病吞咽障碍KEGG通路富集分析气泡图
图3 肝豆汤干预威尔逊病吞咽障碍的PPI图
中药方剂具有药物组成多、成分多样、作用靶点复杂等特点，目前单纯的依靠传统临床研究很难说明其作用机制。然而，近些年兴起的网络药理学就给我们探究中药方剂的作用机制提供了可行的方法。肝豆汤作为威尔逊病的经典用方，且不良反应少，近年来，越来越多的研究表明肝豆汤治疗威尔逊病疗效确切，张静等[13]通过回顾性分析分析了85例威尔逊病患者，发现肝豆汤联合二巯基丙磺酸钠可显著改善威尔逊病认知功能， 血清SOD， Hcy水平显著改善， 驱铜效果明显， 不良反应轻微， 安全有效。方向等[14]通过临床随机对照研究了60例威尔逊病患者，发现肝豆汤联合驱铜治疗可有效改善湿热内蕴型威尔逊病患者平衡障碍，缓解临床症状，提高生活质量。陶庄等[11]研究了80例威尔逊病吞咽障碍患者，结合中医症候、吞咽评价等评分，发现肝豆汤能明显改善威尔逊病吞咽障碍患者吞咽功能障碍症状；
由此可见，肝豆汤具有改善威尔逊病患者临床症状，提高患者生存质量的作用。
根据Cytoscape3.9.1构建的“化学成分-共同靶点”网络图，我们可以得出肝豆汤干预威尔逊病吞咽障碍具有多成分、多靶向的特点，其中槲皮素、汉黄芩素、木犀草素可能在肝豆汤治疗威尔逊病吞咽障碍中起着关键作用。槲皮素是一种黄酮类化合物， 现代药理学研究证实，槲皮素[15]具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗黏附、免疫调节等功效，孙军等[16]研究叶显示，槲皮素可能是通过激活PI3K/Akt信号通路对脑血管内皮细胞发挥保护作用；
现代药理学表明汉黄芩素[17]是黄芩的主要的生物活性化合物，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗炎和保护神经活性，Huynh DL等[18]研
究显示在炎症性疾病中，汉黄芩素抑制炎症细胞因子/趋化因子（IL-6，IL-1β，ifn-γ，tnf-α，RANTES，eotaxin）的产生和氧化应激介质 （COX-2，PGE2，NO，iNOS）通过调节ROS/ MAPK/Nrf2/AP1/nf-κb信号通路；
木犀草素[19]是一种重要的黄酮，存在于多种植物产品中，包括西兰花、胡椒、百里香和芹菜等，大量研究表明，木犀草素[20-21]在体内和体外都具有有益的神经保护作用；
基于以上，我们可以相信本次网络药理学筛选出来的肝豆汤干预威尔逊病吞咽障碍有效成分是可靠的。
通过PPI网络分析，我们可以得出ESR1、MYC、CASP3等可能为肝豆汤治疗威尔逊病吞咽障碍的核心靶点。ESR1[22]即雌激素受体α，是一种核内受体，与其它类固醇激素受体一样，雌激素受体有雌激素结合域、DNA结合域及转录激活域，参与生殖系统的生长、分化，有研究显示ESR1能调节心血管和神经系统的正常功能；
MYC[23]是一种原癌基因，研究表明其在细胞周期进程、凋亡、细胞转化、神经保护中发挥重要作用；
CASP3[24]编码的蛋白质是一种半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，在神经细胞凋亡的执行阶段起着重要作用，赵雯[25]等研究显示肝豆汤可以通过抑制CASP3的表达来减少神经细胞的凋亡。
GO生物富集分析结果表明，肝豆汤干预威尔逊病吞咽障碍主要是通过调节DNA结合转录因子结合（DNA-binding transcription factor binding）、RNA 聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合（RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding）、泛素样蛋白连接酶结合（Ubiquitin-like protein ligase binding）、泛素蛋白连接酶结合（泛素蛋白连接酶结合）、激酶调节活性（kinase regulator activity）等发挥作用。KEGG信号通路富集分析表明，肝豆汤干预威尔逊病吞咽障碍的的信号通路主要有化学致癌受体活化（Chemical carcinogenesis-receptor activation）、脂质与动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶通路（PI3K-Akt signaling pathway）、肝细胞癌通路（Hepatocellular carcinoma）等发挥作用，体现了肝豆汤治疗威尔逊病吞咽障碍是多通路干预的。
肝豆汤是中医临床上治疗威尔逊病吞咽障碍的常用药物，具有很大的应用前景。以上研究通过网络药理学探究，发现了肝豆汤的主要活性成分槲皮素、汉黄芩素、木犀草素等可能作用于ESR1、MYC、CASP3等核心靶点，并通过化学致癌受体活化、脂质与动脉粥样硬化、PI3K-Akt等多条信号通路发挥其抗炎、抗氧化、保护神经细胞、排铜化浊、改善吞咽功能的作用，体现了肝豆汤干预威尔逊病吞咽障碍具有多成分、多靶点、多通路的特点，当然，由于本研究采用网络数据整理、软件分析的方法，还需要更多的证据来证明肝豆汤治疗威尔逊病吞咽障碍的作用机制，因此相关结论还需临床试验进一步论证。
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