甘菊文，谢保平，廖晓飞
（1.赣州市人民医院；
2.赣南医学院心脑血管疾病防治教育部重点实验室，赣州 341000）
骨质疏松症（osteoporosis,OP）是危害中老年人特别是绝经后妇女健康的常见病之一，其特征在于骨量、强度和微结构的系统性损伤，从而增加了脆性骨折发生的倾向[1]。雌激素作用于破骨细胞雌激素受体（Estrogen Receptor,ER），通过ER直接或者通过FasL旁路机制诱导破骨细胞的凋亡，直接抑制破骨细胞的分化或者骨吸收活性[2]。淫羊藿具有补益肾阳、强筋健骨等功效，常用于骨质酥松、骨折后期。淫羊藿苷（Icaritin,ICT）是淫羊藿最重要的单体有效成分[3]。目前研究指出ICT可以抑制破骨细胞（Osteoclast,OC）分化而发挥抗OP的作用[4-5]，但对其抑制破骨细胞分化机理的研究，特别是从雌激素受体水平角度探讨ICT抑制破骨细胞分化的研究报道很少。
1.1 材料ICT（中国科学院成都生物研究所）；
RAW264.7（中国科学院细胞库）；
胎牛血清（Gibco美国），高营养的营养剂（Gibco美国），TRAP染色试 剂 盒 （SIGMA美 国），小 鼠 重 组RANKL（Peprotech美国），甲苯胺蓝zguo染色液（Solarbio美国），氟维司群（ICI182780，美仑生物 中国），4%多聚甲醛（北京鼎国昌盛生物科技有限公司），17-β-雌 二 醇 （E2，SIGMA美 国），MPP（Cayman Chemical美国）。
1.2 方法
1.2.1 实验分组 为了检测ICT是否通过ER抑制破骨细胞的分化，用ICI182780竞争性阻断ER的功能，用TRAP染色方法检测竞争性阻断ER后ICT对破骨细胞分化的影响。分为：Control组、RANKL组、RANKL+ICI182780组、E2(1 μM)组、E2(1 μM)+ICI182780组、ICT(10 μM)组、ICT(10 μM)+ICI182780组，每组设置3个复孔。
1.2.2 TRAP染色 将状态较好的RAW264.7细胞接种于48孔板上，每孔密度为5×103个，12 h后，含ICI182780的 实 验 组 用 浓 度 为1 μM的ICI182780先处理1 h，然后按实验分组换有或者没有ICI180780且含RANKL(50 ng/mL)的培养基培养，每2天换液1次。从第5天开始染色观察细胞（注意破骨细胞成熟或者长大到一定大小时容易破裂），每2 h一次。在37℃条件下预热足够的PBS，用PBS洗涤两次，4%多聚甲醛固定20 min，用预热PBS彻底清洗3次。配制TRAP染液：取1.5 mL EP管，加50 μL氨偶氮苯和50 μL亚硝酸钠混匀30 s，室温静置2 min，得GBC液，取15 mL离心管，加水4.5 mL，GBC液100 μL，萘酸AS-BI磷酸钠液50 μL，醋酸盐200 μL，避光加入酒石酸盐100 μL，充分混匀，得TRAP染液。每孔加入上述染液300 μL，37℃水浴锅中避光孵育1 h，隔30 min观察一次染色情况，待细胞质呈酒红色，细胞核清晰可见时，用37℃PBS冲洗干净(2~3次)，显微镜下观察TRAP染色后的细胞，胞质呈酒红色，细胞核数目大于3的为成熟破骨细胞，将每孔破骨细胞按“井”字样分成9个区域，并统计每孔破骨细胞数，用于统计分析。
1.2.3 骨吸收功能评价 （1）骨片前处理 取新鲜牛股骨骨干，手工制备厚度为100~200 μm的骨片，修剪成48孔板大小。双蒸水超声清洗3次，每次30 min。浸泡于75%酒精中，4℃保存备用。无菌双蒸水或者灭菌PBS清洗骨片3次，紫外照射骨片正反面各30 min。完全培养基浸泡过夜，第2天用于种板。（2）诱导及染色 将状态良好的RAW264.7细胞接种于含有经前处理的骨片的孔板中，使每孔含细胞5×103个。实验组和对照组均每组设3个复孔，培养12 h后，换含药物或者ICI182780和RANKL(50 ng/mL)的培养基，方法同1.2.2。前4天每2天换液1次，第5天开始每天换液，并在骨片的周围可以看到破骨细胞，诱导8天后，用PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，加0.25 mol/L氨水超声清洗3次，每次15 min，依次用60%、70%、80%、90%和100%乙醇脱水，每次脱水5 min，自然晾干，后加入甲苯胺蓝染液染色5 min，显微镜下观察并拍照，用Image-Pro-Plus 6.0软件计算骨吸收面积。
1.2.4 ICT通过ERα抑制破骨细胞分化和骨吸收功能 为了进一步验证ICT是通过ERα/β抑制破骨细胞分化和骨吸收功能，用ERα特异性的阻断剂MPP阻断ERα，用TRAP染色考察ICT对破骨细胞分化的影响，实验分组：Control组、RANKL组、E2组、E2+MPP组、OA(5 μM)组、OA(5 μM)+MPP组、OA(10 μM)组、OA(10 μM)+MPP组，实验方法同1.2.2。用甲苯胺蓝染色评价骨吸收功能，实验分组同上，实验方法同1.2.3。
2.1 ICT通过雌激素受体抑制破骨细胞分化 用TRAP染色检测ICI182780竞争性阻断ER后ICT对破骨细胞分化的影响。与RANKL组相比，ICT(10 μM)和E2(1 μM)显著抑制破骨细胞分化(P＜0.01)；
与ICT(10 μM)和E2(1 μM)单独处理组相比，加入ICI182780处理后，抑制破骨细胞分化的作用减弱；
在没有ICT或者E2存在的情况下，单独用ICI182780处理不影响破骨细胞的分化(P＞0.05)。以上说明ICT可能是通过ER抑制破骨细胞的分化(图1)。
图1 TRAP染色结果与统计结果图
2.2 ICT通过雌激素受体抑制破骨细胞骨吸收功能 为了判断ICT是否通过ER抑制破骨细胞骨吸收功能，用ICI182780与ICT共同处理RANKL诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化，用甲苯胺蓝染色法评价骨吸收功能。结果如图2所示，与RANKL组相比，ICT和E2显著地抑制破骨细胞骨吸收功能(P＜0.01)，ICI182780单独处理组没有抑制效应或者上调破骨细胞的骨吸收功能，但没有统计学意义(P＞0.05)。与ICT或者E2单独处理组相比，ICT或E2与ICI182780共同处理组的RANKL诱导的破骨细胞骨吸收功能更强(P＜0.05)，提示ICT是通过ER抑制破骨细胞骨吸收功能。
图2 甲苯胺蓝染色法评价骨吸收功能的结果图
2.3 ICT通过ERα抑制破骨细胞骨吸收功能 为了进一步验证ICT通过ERα抑制破骨细胞骨吸收功能，用ERα特异性阻断剂MPP阻断ERα，用甲苯胺蓝染色考察ICT对骨吸收功能的影响。与RANKL组相比，各浓度的ICT显著抑制破骨细胞骨吸收功能，且MPP单独处理组上调骨吸收功能，但没有统计学意义(图3)。与ICT或者E2单独处理组相比，加入MPP后，ICT抑制破骨细胞骨吸收功能的作用减弱，差异有统计学意义(图3)。
图3 ICT通过ERα抑制破骨细胞骨吸收功能
OP症主要由于骨组织内的破骨细胞（OC）和成骨细胞(OB)的功能活动平衡被破坏所致[6]。机体内所有促进破骨细胞分化或者抑制成骨细胞生成的因素都能导致OP的发生。OC是机体中唯一具有骨吸收作用的细胞，目前调节OC活性被认为是治疗OP较为直接且有效的方式。雌激素是甾体类化合物，雌激素分泌不足是导致绝经后妇女患OP症的重要原因。雌激素可提高1a-羟化酶活性，促进1,25二羟维生素D3产生，可促进降钙素的分泌和抑制甲状旁腺素的骨吸收[7]。
雌二醇是天然雌激素，通过ER直接抑制破骨细胞功能。RANKL是诱导破骨细胞形成和成熟的必需因子，RANK是破骨细胞膜上RANKL唯一的信号受体，RANKL与破骨细胞膜上受体RANK结合，激活下游信号分子调控破骨细胞的分化[2]。本研究提示ICT具有雌激素样作用，可能通过ER/RANK信号通路抑制破骨细胞分化。
本研究用ICI182780拮抗ER功能后，ICT抑制破骨细胞分化和骨吸收功能的效应减弱，但没有完全抑制，可能的原因有两个，一是ICI182780是雌激素受体的竞争性阻断剂，与ICT竞争雌激素受体作用位点，没有完全阻断雌激素受体；
二是ICT可能有其他途径抑制破骨细胞分化，如RANKL信号通路。为了进一步研究ICT通过ERα抑制RANKL诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化，本研究用ERα特异性阻断剂MPP阻断ERα，用TRAP染色和甲苯胺蓝染色评价阻断ERα后ICT对破骨细胞分化和功能的影响，结果提示ICT可能是通过ERα抑制RANKL诱导的破骨细胞骨吸收功能。
ICT目前主要是作为肝病治疗的辅助药物，本研究旨在阐明ICT的抗OP机制，为ICT抗OP研究提供新的作用靶点，也为开发ICT临床用于抗OP提供理论支持。
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