周蜜, 许文芳, 陈将南, 张宝军, 王章善, 付双杏, 方晓波
绍兴文理学院附属医院 1皮肤科， 2检验科(浙江绍兴 312000)
尖锐湿疣(condyloma acuminatum，CA)是由人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染引起的一种良性细胞增殖性疾病，CA组织类似良性肿瘤。CA主要感染群体为21～50岁的中青年男女[1]。HPV能引起人体皮肤黏膜鳞状上皮细胞增殖，表现为寻常疣、CA等症状[2]。一般感染低危型HPV可引起生殖道、阴茎、宫颈等部位病损，而高危型HPV可引起反复、持续感染[3]。目前临床上低危型HPV是CA的主要发病原因，低危型中以HPV6、HPV11两种最为常见[4]。miR-149-3p在多种癌症类型的肿瘤抑制中发挥重要作用。Zhou等[5]研究显示，低表达miR-149-3p可促进宫颈癌迁移和侵袭。人附睾蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)是医学界近年来发现的肿瘤标志物，主要表达于生殖系统上皮细胞[6]。Shi等[7]研究发现，在结直肠癌中miR-149可通过调控WFDC2(编码HE4蛋白的基因)。因此，本研究选取CA患者80例为研究对象，探究miR-149-3p、HE4在CA组织中表达及与HPV感染的关系。
1.1 一般资料 选取2019年1月至2021年8月本院收治的80例CA患者为研究对象(CA组)，年龄22～56岁，平均(37.18±8.93)岁。纳入标准：(1)符合CA诊断标准[8]；
(2)入组前未经任何治疗。排除标准：(1)伴其他恶性肿瘤；
(2)伴梅毒、艾滋病、生殖器疱疹等其他性病、增生性皮肤病；
(3)既往有外生殖器疾病史；
(4)1个月内服用免疫抑制剂或免疫调节剂、糖皮质激素。另选取50例在本院行包皮环切术患者为对照组，纳入标准：行包皮环切术。排除标准同CA组排除标准相同且无HPV感染。对照组年龄20～54岁，平均(35.42±8.86)岁。CA组、对照组年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
1.2 方法
1.2.1 样本采集 组织取样：CA组患者在本院就诊时切下疣体组织，分两份，置于液氮中保存，然后冻存于-80℃。对照组于本院行包皮环切术时留取正常包皮组织，置于液氮中保存，然后冻存于-80℃。
血液样本取样：CA组患者和对照组在本院检查当天，清晨空腹时抽取静脉血6 mL，离心，留上清液，冻存于-80℃。
1.2.2 实时荧光定量PCR法检测组织中miR-149-3p的水平 使用Trizol RNA提取试剂盒(大连生物工程公司)提取组织总RNA，采用反转录试剂盒(大连生物工程公司)按照操作步骤反转录得到cDNA。miR-149-3p以管家基因U6为内参，采用实时荧光定量PCR仪对组织中miR-149-3p及内参U6进行扩增反应。反应条件：95℃ 3 min；
95℃ 30 s；
58℃ 30 s；
72℃ 30 s；
30个循环。用2-ΔΔCT法计算miR-149-3p相对表达量。引物序列见表1。
表1qRT-PCR引物序列
1.2.3 检测组织中HE4表达 采用免疫组化法(SP法)检测组织中HE4表达，将获取的组织进行石蜡包埋，二甲苯脱腊，梯度酒精水化，3%过氧化氢清除内源性氧化物酶，再进行抗原修复，加山羊血清封闭，滴加一抗，4℃过夜，滴加二抗，孵育，滴加显色液，终止反应，复染、分化、脱水、透明、封片，由两位经验丰富的病理科医生用高倍镜对每张切片随机选5个视野进行分析。按阳性染色面积所占百分比评分：<10%计0分，10%～39%计1分，40%～69%计2分，≥70%计3分。按染色强度评分：不着色计0分，黄色计1分，棕黄色计2分，黄褐色计3分。两次评分乘积为最终综合评分，≤2分为阴性表达，>2分为阳性表达。
1.2.4 检测血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10水平 采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定血清γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-10(interleukin 10，IL-10)水平(试剂盒均由美国R&D公司提供)。
1.3 HPV病毒载量分析 取出CA组织，待解冻后，研磨成组织匀浆，离心2次(12 000 r/min，8 min)，沉淀经过DNA提取裂解后，采用HPV6/11 PCR荧光检测试剂盒处理DNA样品。配制PCR反应管，设置阴性对照、阳性对照标准品梯度。扩增条件：93℃ 2 min，93℃ 45 s，55℃ 60 s，10个循环；
然后93℃ 30 s，55℃ 45 s,30个循环。确定基线和阈值，基线阈值设定，设定原则为3～15个循环的荧光信号，且Ct值为0.00。建立标准曲线，读取DNA含量，单位为DNA模板平均拷贝数。
1.4 统计学方法 采用统计软件SPSS 21.0对数据进行分析，计数资料用例(%)表示，采用2检验。计量资料均符合正态分布，以平均值±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验。采用Spearman法分析CA组织中miR-149-3p与HE4及miR-149-3p、HE4与IFN-γ、TNF-α、IL-10水平的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 CA组和对照组组织中miR-149-3p和HE4的水平比较 与对照组相比，CA组组织中miR-149-3p水平较低(P<0.05)，HE4阳性表达率较高(P<0.05)，见表2、3及图1。
表2 CA组和对照组组织中miR-149-3p的水平比较
表3 CA组和对照组组织中HE4表达比较 例
图1CA组及对照组组织中HE4表达(×400)
2.2 CA组和对照组血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10水平比较 与对照组相比，CA组血清IFN-γ、TNF-α水平较低(P<0.05)，血清IL-10水平较高(P<0.05)，见表4。
表4 CA组和对照组血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10水平比较
2.3 CA患者组织中HPV病毒载量和miR-149-3p、HE4的水平比较 80例CA患者中HPV6/HPV11阳性检出率为82.50%(66/80)。与病毒载量为103～105组相比，105～107组、>107组组织中miR-149-3p水平较低(P<0.05)，HE4阳性表达率较高(P<0.05)，见表5。
表5 HPV6/HPV11阳性CA患者组织中HPV病毒载量和miR-149-3p、HE4的水平关系
2.4 HPV6/HPV11阳性CA患者miR-149-3p和HE4表达水平相关性分析 根据66例HPV6/HPV11阳性CA患者miR-149-3p表达水平中位值(0.55)，将其分为miR-149-3p高表达组33例，miR-149-3p低表达组33例。经Spearman相关分析显示，CA组织中HE4与miR-149-3p表达水平呈负相关(r=-0.445，P<0.05)。见表6。
表6 CA组织中miR-149-3p和HE4表达水平的相关性 例
2.5 CA患者中miR-149-3p和HE4表达水平与IFN-γ、TNF-α、IL-10水平相关性分析 分析显示，miR-149-3p与IFN-γ、TNF-α呈正相关(P<0.05)，与IL-10呈负相关(P<0.05)；
HE4与IFN-γ、TNF-α呈负相关(P<0.05)，与IL-10呈正相关(P<0.05)。见表7。
表7 相关性分析
HPV是一种DNA病毒，根据HPV所侵犯的上皮细胞所在部位分为生殖道型HPV和皮肤型HPV[9]。有学者发现，感染机体HPV后，细胞免疫可清除体内HPV，体液免疫可防止机体被同一亚型HPV再次感染。有学者发现，辅助性T细胞(Th细胞)在机体的免疫系统中扮演关键角色，机体处于健康状态时，Th1细胞与Th2细胞可处于动态平衡，当机体被病毒感染后，两者平衡被打破，病毒感染机体后可引起机体Th1向Th2漂移，如宫颈癌的发生[10]。Th1细胞可分泌IFN-γ、TNF-α，介导细胞免疫，Th2细胞可分泌IL-10介导体液免疫。当Th2细胞占优时，Th2细胞因子会过表达，导致机体细胞免疫功能受到抑制。本研究发现与对照组相比，CA组血清IFN-γ、TNF-α血清较低，血清IL-10水平较高，提示CA患者可能存在细胞免疫功能抑制。
microRNA在基因转录后调控中发挥关键作用，参与细胞增殖，免疫调节等生物过程。miR-149-3p具有多种生理功能。越来越多的证据表明，miR-149-3p是一种新型的癌症相关microRNA，在抑制增殖、迁移方面发挥着重要作用[11]。Yang等[12]研究显示，过表达miR-149-3p可抑制膀胱癌的增殖、迁移和侵袭。有研究报道，miR-149-5p是调控HPV阳性的宫颈鳞状细胞癌的关键因子，在HPV阳性宫颈鳞状细胞癌发展中起关键作用[13]。本研究显示CA组组织中miR-149-3p水平较对照组低，105～107组、>107组组织中miR-149-3p水平较103～105组低，提示miR-149-3p的降低可能参与CA疾病发生，且miR-149-3p水平变化可能与HPV感染有关。miR-149-3p还可调节机体炎症，Shen等[14]研究发现，miR-149-3p过表达可抑制NF-κB信号通路并减弱TNF-α的分泌，减轻慢性阻塞性肺疾病患者炎症反应。Xu等[15]研究发现，miR-149-3p可减少调节性T细胞分化从而抑制食管癌小鼠发生免疫逃逸，过表达miR-149-3p可降低IL-10水平。本研究显示miR-149-3p与IFN-γ、TNF-α呈正相关，与IL-10、HE4呈负相关，提示miR-149-3p可能与HE4、IFN-γ、TNF-α、IL-10共同作用调控CA病情。
HE4也称为WFDC2，在位于人附睾远端的上皮细胞上首次发现其存在。HE4是一种新型肿瘤生物标志物。有研究表明，HE4在子宫内膜癌中具有重要的诊断价值[16]。有分子细胞学实验也表明，HE4可通过调控多个分子通路参与肿瘤的增殖、侵袭等恶性生物学行为[17]。王元元等[18]研究显示，HE4对宫颈癌的诊断具有较高诊断价值。本研究结果显示，CA组组织中HE4阳性表达率明显高于对照组，105～107组、>107组组织中HE4阳性表达率明显高于103～105组，提示HE4可能与CA疾病发生有关，且HE4水平变化可能与HPV DNA载量有关。Zhang等[19]研究显示，卵巢癌患者血清中HE4水平与IL-10呈正相关。另有研究发现，接受依伐卡托的囊性纤维化患者的血清HE4水平与肺功能改善程度呈负相关，囊性纤维化患者血清中HE4水平随血清IL-10、IL-6水平升高而升高[20-21]。本研究分析显示，CA组织中HE4与IFN-γ、TNF-α呈负相关，与IL-10呈正相关，提示HE4可能与IFN-γ、TNF-α、IL-10共同作用调控CA病情。
综上所述，HPV6/HPV11病毒载量高CA组织中miR-149-3p表达水平较低、HE4阳性表达率较高，miR-149-3p、HE4均与IFN-γ、TNF-α、IL-10密切相关，但本研究尚未深入探讨miR-149-3p、HE4与CA发病机制的关系，仍需扩大样本量深入探讨。
利益相关声明：所有作者声明无利益冲突。
作者贡献说明：周蜜：提出研究选题、设计方案、论文撰写；
许文芳、陈将南：实验操作、分析实验数据；
张宝军、王章善、付双杏、方晓波：临床及病理资料收集、数据整理。