郝甜甜，陈艳阳，苗佳琪，牛 晨，梁 佳，许永华
吉林农业大学中药材学院 人参新品种选育与开发国家地方联合工程研究中心，长春 130118
西洋参(American ginseng，AG)PanaxquinquefoliusL.是五加科人参属多年生草本植物，其主要活性成分是人参皂苷、皂苷类化合物，它是世界上最常用的中草药之一[1]。根据现代研究表明，其在降血脂、改善心肌缺血、预防癌症等方面有显著功效[2,3]，具有极高的医学价值和商业价值。目前，我国西洋参长期依靠进口且面临野生资源稀缺，生产成本高、生长周期长，特别是西洋参中稀有皂苷的含量极低，难以满足临床应用需求[4,5]。采用药用植物细胞培养技术，不受时间、地域和材料生长时期的限制，可以在较短时间内获得大量的西洋参生物量及目标次生代谢产物[6]，值得注意的是，建立起来的西洋参愈伤组织培养系统仍然存在着人参皂苷产量低的问题，影响着西洋参产业的快速发展[7]。
随着诱导子的不断发展和广泛应用，关于诱导子作为一种特定信号，诱导细胞中目的基因表达，从而调节植物细胞中次生代谢产物合成已成为热点[8]，而将诱导子用于植物组织培养中促进次生代谢产物的积累研究也变的尤为重要。茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)和水杨酸(salicylic acid，SA)作为一种常用的诱导子，对多种代谢产物合成具有促进作用，已成功应用于雷公藤、红花、黄芩、丹参等多种药用植物次生代谢产物的诱导中[9-12]。目前利用MeJA和SA处理西洋参愈伤组织提高皂苷含量的报道很少。因此，本试验以西洋参愈伤组织为材料，研究了MeJA和SA处理后对西洋参愈伤组织生长、相关酶活性及主要化学成分人参皂苷含量的影响，为西洋参愈伤组织培养及其次生代谢产物生产提供理论依据。
1.1 材料
实验材料：供试材料培养于吉林农业大学中药材学院温室A04，两年生西洋参叶片为试验材料。由吉林农业大学许永华副教授鉴定为五加科植物西洋参PanaxquinquefoliusL.。以1/4 MS培养基为基本培养基，分别添加6-BA 1.0 mg/L、2,4-D 2.0 mg/L、蔗糖30 g/L、琼脂6.5 g/L，pH=5.8。培养条件为暗培养，温度(25±2)℃，湿度60%。
实验仪器：实验高压灭菌器(致微仪器有限公司，GI54DWS型)；
双人单面净化工作台(浙江苏净净化设备有限公司，SW-CJ-2FD型)；
智能人工气候室(南京恒裕仪器设备制造有限公司，FYS-10型)；
高效液相色谱仪(美国通微公司，Dionex UltiMate 3000型)；
MuItiskan GO酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司-中国)；
ST16R高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司-中国)。
实验试剂：MeJA(北京索莱宝科技有限公司，批号：20200118，纯度≥95.0%)；
SA(北京中科质检生物技术有限公司，批号为：B20191128，纯度≥98.0%)；
乙腈和甲醇均为色谱纯(赛默飞世尔科技有限公司-中国)；
纯净水(杭州哇哈哈集团有限公司)；
SOD试剂盒、CAT试剂盒、POD试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司，货号分别为SOD-1-Y、CAT-1-Y、POD-1-Y)。
1.2 方法
1.2.1 试验设计
西洋参愈伤组织在培养第 15 d加入诱导子，浓度分别设置为MeJA(50、100、200、300 μmol/L)；
SA(50、100、200、300 μmol/L)；
以不添加任何诱导子为对照，每个浓度3次重复，10瓶为一重复，25 ℃暗培养，至35 d收获。
1.2.2 西洋参愈伤组织中生长量的测定
将收获的人参愈伤组织用滤纸吸干其表面水分，称其重量记为鲜重(fresh weight，FW)，每6盘一组，重复3次，然后置于50 ℃ 烘箱中烘干至恒重，称重记为干重(dry weight，DW)。
1.2.3 抗氧化酶活性的测定
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性测定采用羟胺法，过氧化物酶(peroxidase，POD)活性测定采用愈创木酚法，过氧化氢酶(catalase，CAT)活性测定采用可见光法，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸比色法，具体操作方法参照试剂盒说明书。
1.2.4 西洋参愈伤组织中单体皂苷含量的测定
(1)色谱条件：Waters XBridge®C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；
流速：1 mL/min；
柱温：35 ℃；
流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱：0～35 min，19% A；
35～50 min，19% A→22% A；
50～108 min，22%A→45% A；
蒸发光散射检测器漂移管温度：75 ℃，气体流量：2.5 L/min，增益值：1。
(2)样品中皂苷的提取方法：称取愈伤组织100 mg，精密加入1 mL的甲醇，超声1 h，置于4 ℃ 冰箱过夜，取出，超声3 h，5 000 r/min 离心5 min，取上清，过0.22 μm滤膜，待高效液相色谱仪检测，进样量20 μL。
(3)标准曲线制备：精密称取标准品人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rb3和Rd适量，加甲醇制成每1 mL分别含上述人参皂苷0.200、0.200、0.194、0.200、0.224、0.210、0.200、0.190、0.204 mg的混合标准品溶液。取上述混合标准品溶液，分别进样1、2、4、8、16、20 μL，测定各种人参皂苷的峰面积，色谱图见图1。
图1 标准品(A)与西洋参愈伤组织提取物(B)的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of standard (A) and AG callus extract (B)
1.2.5 西洋参愈伤组织中总皂苷含量的测定
采用香草醛-高氯酸法测定愈伤组织中总皂苷的含量，参考于2020版《中国药典》[13]，修改处为：取愈伤组织100 mg，精密加入1 mL甲醇，超声60 min，4 ℃冰箱过夜，超声3 h。5 000 r/min离心5 min，取上清，待测。其他步骤均同《中国药典》。以人参皂苷Re为对照品，所得标准曲线为Y=0.002 2X+0.038 7，R2=0.997 5。
1.2.6 数据统计与分析
本试验数据均使用Microsoft Excel 2019进行统计整理，SPSS 18.0软件进行统计分析，通过方差分析对比数据差异显著性；
采用OriginPro 2018软件绘制试验数据图。
2.1 不同浓度诱导子对西洋参愈伤组织生长的影响
由图2分析可知，不同浓度诱导子处理对西洋参愈伤组织FW及DW的影响不同。在西洋参愈伤组织中，(1)与对照组相比，各浓度MeJA诱导子处理均显著降低了愈伤组织的FW，但各浓度处理间的愈伤组织FW并无显著性差异(P>0.05)，说明MeJA能明显抑制西洋参愈伤组织的生长；
不同浓度的MeJA均会不同程度抑制西洋参愈伤组织干物质的积累，其浓度越高，抑制效果越强。当MeJA浓度为300(μmol/L)时，西洋参愈伤组织DW最低，为0.670 7 g，比对照组降低了27%(P<0.05)。(2)在供试浓度内，SA诱导子对西洋参愈伤组织的生长表现为一定的抑制作用，且诱导浓度不同，对愈伤组织生长的抑制强弱有明显差异；
与对照组相比，各浓度SA均不利于愈伤组织干物质的积累。
图2 不同浓度诱导子对西洋参愈伤组织FW和DW的影响Fig.2 Effects of different concentrations of inducers on FW and DW in callus of AG注：图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。Note:Different lowercase letters in graph indicate significant differences (P<0.05),the same below.
2.2 不同浓度诱导子对西洋参愈伤组织抗氧化酶活性及MDA含量的影响
由图3分析可知，在西洋参愈伤组织中，(1)同一诱导子处理组下，西洋参愈伤组织中SOD和CAT的活性随诱导子浓度变化的趋势并不一致。在供试浓度内，MeJA和SA处理组SOD、CAT活性均显著高于对照组(P<0.05)。经50 μmol/L浓度MeJA和100 μmol/L浓度SA处理后的西洋参愈伤组织中SOD的活性均达到高峰值，分别为对照组的1.84、2.04、1.94、1.90倍；
经100 μmol/L浓度MeJA、50 μmol/L浓度SA处理后的西洋参愈伤组织中CAT活性均达到活性高峰。(2)MeJA和SA的作用浓度对西洋参愈伤组织中POD活性的影响趋势一致，均随着诱导子浓度的增加呈现出先上升后下降的趋势，POD活性诱导峰值分别出现在50 μmol/L浓度MeJA和100 μmol/L浓度SA诱导下。与对照组相比，50 μmol/L至200 μmol/L浓度MeJA能显著促进MDA含量的增加(P<0.05)；
在SA诱导子试验组内，低浓度SA对MDA含量无显著影响，高浓度SA能显著促进MDA含量的积累。
图3 不同浓度诱导子对西洋参愈伤组织中抗氧化酶活性及MDA含量的影响Fig.3 Effects of different concentrations of inducers on antioxidant enzyme activity and MDA content in callus of AG
2.3 不同浓度诱导子对西洋参愈伤组织皂苷的影响
2.3.1 不同浓度诱导子对西洋参愈伤组织总皂苷的影响
由图4分析可知，与对照组相比，各浓度诱导子均能显著促进西洋参愈伤组织中总皂苷含量和产量的增加(P<0.05)。在MeJA诱导作用下，总皂苷的含量和产量随着其作用浓度的增加呈现先增加后下降的趋势，但在SA诱导子作用下，总皂苷的含量和产量随着作用浓度的增加呈现出先增加后趋于平稳的趋势。(1)当MeJA浓度为100 μmol/L时，愈伤组织中总皂苷含量和产量均达到最大值，分别为31.495 8 mg/g和24.465 3 mg，是对照组的4.23和3.86倍。(2)在SA诱导子试验组中，当SA浓度为300 μmol/L时，西洋参愈伤组织中总皂苷含量和产量均达到最大值，分别为18.537 6 mg/g和14.085 3 mg，是对照组的2.49和2.22倍，但与200 μmol/L浓度SA处理组之间无显著性差异(P>0.05)。
图4 不同浓度诱导子对西洋参愈伤组织中总皂苷的影响Fig.4 Effects of different concentrations of inducers on total saponins in callus of AG
2.3.2 不同浓度诱导子对西洋参愈伤组织单体皂苷含量的影响
由图5分析可知，与对照组相比，经适宜浓度MeJA和SA处理的西洋参愈伤组织中单体皂苷的含量均有明显提高(P<0.05)。(1)当MeJA浓度为100 μmol/L时，人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc的含量最高，其含量为2.576 0、2.291 3、7.493 3、0.600 7 mg/g，是对照组的3.78、3.74、3.77、3.11倍。(2)经200 μmol/L浓度SA处理的人参皂苷Rg1、Re、Rg2、Rb2的含量最高，其含量为1.874 0、1.712 3、0.517 3、1.517 0 mg/g，是对照组的2.75、2.79、11.50、1.45倍。当SA浓度为300 μmol/L时，人参皂苷Rb1的含量最高，为2.885 3 mg/g，是对照组的5.78倍。
图5 不同浓度MeJA和SA对西洋参愈伤组织中单体皂苷含量的影响Fig.5 Effects of different concentrations of MeJA and SA on monomoside saponins content in callus of AG
虽然诱导子能够促使植物细胞有目的性的分泌某些次生产物，满足人类所需求的药用价值,但所产生的这类次生产物也可能对植物细胞自身的生长发育造成损伤，降低植物细胞的生物总量。Mao等[14]通过不同浓度的诱导子进行正交实验研究表明，不同浓度的MeJA和酵母提取物对朱砂愈伤组织的生长具有不同的生理作用；
此外，Miao等[15]在试验中用HPLC测定香豆素含量结果表明，SA和MeJA对北沙参愈伤组织生长及香豆素均有一定的促进作用；
Wang等[16]在试验中指出50～100 μmol/L浓度MeJA会促进银杏悬浮细胞中黄酮含量的积累，150～200 μmol/L浓度则会抑制其合成。本试验中选用的MeJA和SA诱导子均对西洋参愈伤组织的生物量产生影响，均阻碍西洋参愈伤组织生长。这可能是因为高浓度的诱导子能激发植物体内多种胁迫反应，致使细胞内膜系统膨胀、收缩或破损等，破坏了细胞的正常结构，进而抑制了植物组织的生长。
正常条件下生长的植物细胞受到外源诱导子刺激时，细胞内的活性氧水平会表现出不同程度的失调。植物细胞会启动自身的抗氧化酶系统，利用SOD、CAT、POD等酶的相互协调配合，以清除体内过剩的自由基，从而保护植株在不良环境下免遭破坏。MDA作为细胞膜脂发生过氧化时的产物，能间接反应植物细胞膜系统受损程度以及植物的抗逆性[17,18]。Li等[19]研究指出，SA和MeJA对SOD、POD、CAT活性，MDA含量及远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖的积累均具有促进作用。Taimoor等[18]发现荞麦愈伤组织中POD和SOD活性随着SA作用时间的延长呈现出先上升后下降的趋势，在第7周时活性最高。Marziyeh等[20]发现4%和6%浓度聚乙二醇显著增加了红豆杉愈伤组织中MDA含量，但1%、2%、3%和5%浓度聚乙二醇对MDA含量没有影响。在本研究中发现2种诱导子在适宜浓度下均可以显著激活西洋参愈伤组织中抗氧化酶SOD、CAT、POD活性和MDA含量，超出浓度范围相关酶活性低于对照组，这可能是因为诱导子对抗氧化酶活性影响都有一定限度，如果超过限度，会使酶活性大大降低，致使细胞内活性氧大量积累，从而会危害植物细胞的正常生长。
大量研究表明，不同诱导剂和浓度对同一植物材料的影响有很大差异。例如，通过添加乙酸钠、SA和Cu2+能不同程度有效的提高北柴胡不定根的产量和柴胡皂苷的含量[21]；
低浓度的稀土元素Ce3+能增加银杏悬浮细胞中黄酮类化合物的产生，但是高剂量的Ce3+会导致细胞死亡[22]。在同一植物中，诱导子诱导次生代谢产物的最佳浓度也不相同。Qi等[23]发现在绞股蓝毛状根培养中，MeJA、SA和酵母提取物的最佳添加浓度不同，分别不同程度增加毛状根生长量及总皂苷含量。本试验中发现，在西洋参愈伤组织中，2种诱导子均能显著促进人参皂苷的积累，其中MeJA和SA诱导人参皂苷的最佳浓度分别为100、200 μmol/L，分别是对照组的4.23、2.49倍。另外发现，不同诱导子及浓度影响西洋参愈伤组织中单体皂苷的合成，其中对单体皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rc、Rb2的影响变化很大。由此得出，在西洋参愈伤组织中，诱导效果为MeJA>SA。在西洋参组织培养中，酵母提取物、SA、硝酸银、氯化钙、MeJA、真菌诱导子都能提高人参皂苷的含量，我们的结果与其一致[24-26]。这种结果可能是由多种因素共同作用导致，原因可能与不同诱导子的受体种类、数量有关，虽然低浓度的诱导子对细胞的伤害较小，但可能只会引起植物细胞的部分诱导，使次生代谢产物的含量达不到最高值；
也可能与西洋参愈伤中各个内源细胞分裂素水平不同有关，导致次生代谢产物在植物体内涉及多个合成途径及反应步骤不同，不同诱导子所参与的合成通路不同。因此，选择合适的诱导子以及最佳的浓度促进西洋参愈伤生长和人参皂苷积累尤为重要。
次生代谢产物是植物在长期进化中对生态环境适应的结果,在植物生命活动中有重要意义，还是许多药物、染料、香料等化合物的重要来源[27]。诱导子是在植物组织培养中诱导新的次生代谢产物或增强生物合成以及积累次生代谢产物最有效和最广泛使用的生物技术工具之一[14]。本试验考察了MeJA和SA诱导子对西洋参愈伤组织生长、相关酶活性及人参皂苷含量的影响，结果表明在西洋参愈伤组织中添加适当浓度MeJA和SA均可以显著激活相关酶活性，提高人参皂苷化合物含量，虽然MeJA抑制生长，但是MeJA浓度为100 μmol/L时，愈伤组织中总皂苷含量和产量均达到最大值，人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc的含量最高，所以MeJA诱导人参总皂苷的效果最好。本文为利用诱导子促进西洋参有效成分合成提供了依据，但关于诱导子调控西洋参愈伤中人参皂苷积累的机理，以及如何更有效地协同利用诱导子促进西洋参愈伤品质的提高，是后续实验中需要解决的问题。
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