杨慧明, 沈 冲, 孟 琴
面向微流控肺芯片的水凝胶薄膜制备及其性能研究
杨慧明, 沈 冲, 孟 琴
(浙江大学 化学工程与生物工程学院，浙江 杭州 310027)
微流控肺芯片是一种肺细胞的三维培养装置，其核心部件为一层聚二甲基硅氧烷(PDMS)多孔薄膜，但其存在硬度高、疏水性强、细胞相容性差等缺陷。为更好地模拟人体肺泡，拟制备一种基于甲基丙烯酰化明胶(Gel-MA)和丙烯酸酯化聚醚F127(F127-DA)的共聚水凝胶薄膜，替代PDMS用于肺芯片构建。结果显示，利用表面张力将等体积比的Gel-MA和F127-DA单元溶液在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜圆孔内形成液膜，随后紫外引发共聚反应，制得共聚水凝胶薄膜，平均厚度为35 μm，并具有多孔三维网状结构。该水凝胶薄膜的杨氏模量为13.55 kPa、断裂延伸率为57.05%，力学性能可满足肺芯片的构建需要；
此外，水凝胶薄膜对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人肺泡上皮细胞(HPAEpiC)具有良好相容性；
同时，该水凝胶薄膜的氧气扩散系数为1.40´10-3cm2×min-1，说明其氧气传递性能良好。总之，该水凝胶薄膜的各项指标与肺泡的性质均较为接近，从而为构建符合人体生理学的新型微流控肺芯片提供了新材料。
肺芯片；
水凝胶薄膜；
力学性能；
细胞相容性；
氧气传递性能
随着微制作技术的快速发展，基于微流控的器官芯片受到极大关注。肺芯片作为一种器官芯片，能够在体外精确模拟肺泡的三维微环境，可用于构建符合患者自身条件的疾病模型，从而实现个体化精准治疗[1-3]。
肺芯片的核心部件是由一层渗透膜和膜两侧肺上皮细胞、血管内皮细胞组成的气液屏障[4]。渗透膜需具备一定的弹性和可渗透性，常见的材料有聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚碳酸酯(PC)和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)等高分子材料。其中，PDMS制备的多孔柔性膜是最常见的渗透膜，其厚度约为10 µm，微孔直径为8～10 µm[5-8]，许多研究者利用其构建了由气压驱动的可呼吸肺芯片，可模拟细菌入侵肺泡过程[9]，已被用于肺癌转移[10]和肺血栓发生机理[11]等方面的研究。但是，PDMS渗透膜的杨氏模量远大于人体肺组织[12-13]，且由于其疏水性强导致细胞相容性差；
此外，该材料不透水，需在膜上制备工艺繁杂的微孔阵列，以便细胞养分运输和信号交流，因此PDMS并非良好的构建材料[14]。
与上述高分子材料不同，水凝胶具有软而湿、传递性能好的特点，更加贴合体内细胞生存环境[15-19]。研究表明，相对于表面硬度大的材料，在较软的水凝胶上，间充质干细胞展现出较多的丝状伪足，细胞骨架更为分散[20-21]；
而且细胞对药物及外界刺激的反应也受到基底硬度影响。例如，3D水凝胶细胞培养能更加真实地反映肺癌转移中的细胞侵袭过程，可用于抗癌药物的研发[22]。然而，目前为止，尚未见到采用水凝胶薄膜构建肺芯片的报道，这是因为大多数水凝胶的机械强度差[23-25]，旋涂法[26]和相界面法[27]等制得的微米级水凝胶薄膜由于缺少硬质材料的支撑常难以铺展，不能承受拉力且易溶胀变形，从而限制了其应用。
为此，本研究利用由丙烯酸酯化聚醚F127(F127-DA)与甲基丙烯酰化明胶(Gel-MA)制备的共聚水凝胶单元溶液的表面张力，在开孔的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜上共聚制备了不会溶胀的水凝胶薄膜。该水凝胶薄膜以PET硬质膜为支撑，依靠二苯甲酮(BP)的光活性实现水凝胶与PET之间的键合，从而得到满足肺芯片构建要求的水凝胶薄膜。
2.1 材料与试剂
普朗尼克F127、四甲基偶氮唑蓝(MTT)和丙烯酰氯均购自美国Sigma公司；
用于微生物学的明胶购自阿拉丁(上海)有限公司；
甲基丙烯酸酐购自上海麦克林生化科技有限公司；
光引发剂Irgacure 2959购自德国巴斯夫公司；
达尔伯克氏(DMEM)高糖培养基、胎牛血清(FBS)和磷酸盐缓冲液(PBS) 均购自美国赛默飞公司；
胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)购自上海生物工程有限公司；
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人肺泡上皮细胞(HPAEpiC) 均购自上海冠导生物工程有限公司；
PET膜购自上海亿伟机电五金有限公司；
其余药品和试剂均为国产分析纯。
2.2 水凝胶单元及其溶液的制备
F127-DA的制备：称取13 g普朗尼克F127溶于50 mL四氢呋喃，完全溶解后将体系置于0 ℃冰浴，向溶液中加入1 920 μL三乙胺(TEA)，然后以1 mL×min-1的速率向体系滴加质量浓度为130 mg×L-1的丙烯酰氯-四氢呋喃溶液15 mL，密封上述反应体系。冰浴条件下反应1 h后将反应体系升至室温，然后继续反应24 h。反应结束后高速离心去除三乙基氯化铵，上清液蒸干溶剂后用乙醚清洗残留的杂质，旋蒸去除乙醚可得到白色粉末状F127-DA[28]，反应原理如图1(a)所示。
Gel-MA的制备：称取10 g明胶溶于100 mL水，于50 ℃下溶解充分后逐滴加入3 mL甲基丙烯酸酐，滴加速率为0.5 mL×min-1，在50 ℃、密封条件下反应3 h，反应结束后向体系加入5倍体积的水稀释以终止反应。将溶液装入截留分子质量8 000～14 000的透析袋中，40 ℃热水透析3 d后冻干，得到Gel-MA固体产物，反应原理如图1(b)所示。
图1 F127-DA和Gel-MA合成路线图
单元溶液的制备：称取3 g F127-DA固体溶于17 mL水，得到两者质量比为0.15的单元溶液；
称取2 g Gel-MA固体溶于18 mL水，得到两者质量比为0.1的单元溶液。在上述2种单元溶液中各加入质量分数为0.4%的光引发剂Irgacure 2959。
2.3 水凝胶薄膜的制备
水凝胶薄膜的制备：将开孔PET膜用含有BP质量分数为10%的丙酮溶液处理30 min，并用乙醇冲洗多余的BP溶液，烘干后浸入Gel-MA与F127-DA单元溶液体积比(Gel-MA):(F127-DA)=1:1的共聚水凝胶(Gel-MA/F127-DA(1/1))单元溶液中，利用溶液的表面张力在开孔处形成一层液膜，拭去多余溶液后紫外照射固化。
2.4 细胞培养
将HUVEC和HPAEpiC于DMEM细胞培养液(含体积分数10%的FBS)中进行常规传代培养，培养箱温度为37 ℃，CO2体积分数为5%。选择处于对数生长期的细胞，取HUVEC和HPAEpiC的细胞液10 μL接种于水凝胶薄膜表面，细胞密度为3 000个×μL-1。置于12 孔板内，缓慢添加培养基1.5mL进行培养，每隔2 d更换培养基。
2.5 测试表征
水凝胶薄膜厚度测量：水凝胶膜沿径向剪开后，贴在载玻片上。使用IX71型倒置显微镜(奥林巴斯株式会社)观察其厚度的径向分布，直径十等分固定取11个点，并利用标尺测量其厚度。
细胞活率测定：HUVEC和HPAEpiC培养至第5天后通过MTT法测定细胞活率。具体做法是：加入0.3 mg×mL-1的MTT溶液，经37 ℃温育4 h后，吸去溶液，并向其中加入HCl酸化的异丙醇，室温震荡1 h，最后，通过酶标仪将所得溶液于570 nm下测定吸光度。其中，对照组为培养皿上培养的细胞。
傅里叶变换红外光谱(FT-IR)表征：将水凝胶样品真空干燥后研碎，与KBr粉末混合压片。用IS5型傅里叶变换红外光谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)试验，扫描波数范围为500～4 000 cm-1。
扫描电子显微镜(SEM)表征：水凝胶样品置于1～4 LD Plus型冷冻干燥机(德国Christ公司)冷冻干燥48 h，对样品表面喷金处理，使用SU-8010场发射扫描电子显微镜(日本日立公司)对水凝胶进行表面分析。
机械强度表征：拉伸试验前记录水凝胶片的截面积，并测量夹具间样品原始长度。用Zwick/Roell Z020型万能力学试验机(德国Zwick公司)测定应力～应变曲线，以断裂强度对应的应变计算杨氏模量。测定条件：温度为25 ℃、湿度为50%、拉伸速率为4 mm×min-1。
水凝胶氧气扩散系数的测定：3D打印树脂扩散池的传质面积为0.785 cm2，液池体积为3.3 mL。水凝胶膜厚度为2mm，夹在气室和液室之间。插入DO-957型溶解氧电极(上海雷磁仪器公司)后将扩散池置于密闭的环境中，通过N2吹扫获得无氧环境，避免测量误差；
气室通空气，液室为经N2吹扫后不含氧气的水。测定条件为25 ℃、湿度100%。根据菲克定律计算氧气扩散系数，如式(1)所示。
式中：为氧气质量，g；
为时间，min；
为液池体积，mL；
为液池内氧气质量浓度，g×mL-1；
¢-为空气和液池中的氧气质量浓度差，g×mL-1；
O2为氧气扩散系数，cm2×min-1；
为传质面积，cm2；
为水凝胶厚度，cm。
2.6 统计学分析
细胞覆盖率统计：采用5点取样法，利用网格目镜统计细胞覆盖面积与视野比值，作为细胞覆盖率。所有实验重复3次，每次实验设置3个平行样。显示结果为平均值，当出现偏离原假设值的概率(P值)小于0.05时，说明对比组之间的差异具有统计学意义。
3.1 水凝胶薄膜的制备
图2(a)为边长1 cm的正方形PET膜，利用打孔器在其中心开孔，孔的直径分别为2、3和4 mm。图2(b)是以经BP处理的PET膜(开孔直径为4 mm、厚度为25 μm)为支架、加载水凝胶单元溶液后再紫外照射制得的水凝胶薄膜。当BP被紫外照射后，通过系间窜越迅速由单线态转变为三线态[29]。此时，BP能够夺取PET的氢原子产生表面自由基[30]，引发水凝胶和PET之间的键合。
图2 系列孔径的PET膜与水凝胶薄膜
水凝胶薄膜厚度与PET膜厚度呈正相关，与开孔直径呈负相关，结果如图3(a)所示。使用开孔直径为4 mm、厚度为25 μm的PET膜可制得平均厚度为35 μm的水凝胶薄膜。图3(b)为以水凝胶薄膜直径为主轴、圆心为原点得到的水凝胶薄膜厚度径向分布。受重力影响，薄膜具有中间厚、边缘薄的特征，且边缘厚度接近PET膜厚。图4为水凝胶薄膜径向剖面的显微镜照片。
图3 厚度可调的水凝胶膜的制备及水凝胶膜厚度的径向分布
3.2 水凝胶薄膜的结构与形貌
图5为F127-DA水凝胶、Gel-MA/F127-DA(1/1)及其原料的FI-TR谱图。由图可见，F127-DA水凝胶在1 731 cm-1处出现特征吸收峰，表明F127端羟基与丙烯酰氯反应生成了酯羰基。1 642 cm-1为酰胺I带的吸收峰，主要由C═O伸缩振动引起；
1 530 cm-1附近为酰胺II带的吸收峰，由C─N伸缩振动和N─H弯曲振动耦合引起。Gel-MA的酰胺特征峰明显强于纯明胶Gel的相应峰，表明甲基丙烯基团被接枝到了明胶分子链。
图4 水凝胶膜径向厚度的显微镜照片
图5 水凝胶及其原料的FT-IR图
(a) Gel (b) Gel-MA (c) F127 (d) F127-DA (e) Gel-MA/F127-DA(1/1)
不同体积比((Gel-MA)/(F127-DA)为1/3、1/2、1/1、2/1)的Gel-MA/F127-DA共聚水凝胶的SEM形貌如图6所示。由图可见，Gel-MA/F127-DA共聚水凝胶表面呈三维多孔网状结构，孔道分布较为均匀。由于Gel-MA分子质量较低，Gel-MA添加比例增大会导致孔道变小。当Gel-MA与F127-DA的单元溶液体积比为2:1时，多孔结构几乎不存在，呈现出凹凸不平的表面。
图6 不同体积比的Gel-MA/F127-DA共聚水凝胶的SEM图
3.3 水凝胶的机械强度
力学性能是影响水凝胶在生物医学领域应用的关键因素。图7为不同体积比的Gel-MA/F127-DA共聚水凝胶的应力～应变曲线，表1是共聚水凝胶的力学性能。结果表明，随Gel-MA添加比例增大，水凝胶的杨氏模量、断裂延伸率和抗张强度逐渐降低。由表1可见，Gel-MA与F127-DA单元溶液体积比(Gel-MA):(F127-DA)从0 (纯F127-DA)变为2:1时，水凝胶的杨氏模量和抗张强度由23.68和26.86 kPa降至9.87和3.08 kPa，相应的断裂延伸率从119.84%降至31.18%。影响水凝胶力学强度的因素主要有3个方面：水凝胶结构、介质组成和含水量[31]。F127-DA只有端基存在丙烯基团，聚合过程中会形成长的大分子链，具有较高的韧性。而未加修饰的明胶基水凝胶力学强度低，具有软而脆的特点[32]。因此，Gel-MA/F127-DA共聚水凝胶的强度与Gel-MA添加比例呈负相关。
图7 不同体积比的Gel-MA /F127-DA共聚水凝胶的应力～应变曲线
表1 不同体积比的Gel-MA /F127-DA共聚水凝胶的力学性能
人肺的弹性模量随着肺部扩张程度的变化而不断改变。在正常呼吸过程中，肺的杨氏模量为12～20 kPa[33-34]。(Gel-MA):(F127-DA)为1:3、1:2和1:1的共聚水凝胶的杨氏模量均与其接近。而(Gel-MA):(F127-DA)=2:1的水凝胶杨氏模量只有9.87 kPa，强度较弱。此外，PDMS预聚体与固化剂的浓度比在10:1时，其杨氏模量约为700kPa，其硬度远超肺组织的杨氏模量[13]，因此不适宜用作微流控肺芯片的构建材料。
3.4 水凝胶薄膜的细胞相容性
细胞必须先在材料表面贴附，才能迁移、增殖和分化。细胞在PDMS膜表面基本不贴附，通常需要表面功能化来增强细胞相容性[35]。而水凝胶一般具有良好的细胞相容性[36]，因此，本研究对Gel-MA/F127-DA共聚水凝胶的细胞相容性进行了考察。图8是HUVEC在不同配比水凝胶薄膜表面培养3 d后在倒置显微镜下观察到的贴壁状况。由图可见，HUVEC在F127-DA水凝胶表面几乎不贴壁生长，这是因为F127的聚环氧乙烷链段具有抗细胞黏附特性[37]；
Gel-MA/F127-DA(1/1)的表面细胞生长状况最佳，贴壁后的细胞呈梭形。为了量化细胞在水凝胶薄膜表面的贴壁程度，对HUVEC和HPAEpiC的生长覆盖率进行了统计，结果见图9(a)、(b)。由图可见，Gel-MA/F127-DA(1/1)共聚水凝胶的细胞覆盖率最高，且HUVEC的生长速度快于HPAEpiC。图9(c)为HUVEC和HPAEpiC相对于培养皿上培养的细胞的活率。由图可见，细胞活率即细胞相容性，与Gel-MA添加比例呈正相关，Gel-MA/F127-DA(1/1)共聚水凝胶的细胞生长状况与细胞培养皿(对照组)接近。这是由于Gel-MA结构上具有细胞黏附位点及基质金属蛋白酶水解位点，促进细胞的生长[38]，使F127-DA的抗黏附性影响降低。
图8 不同体积比的Gel-MA/ F127-DA共聚水凝胶的HUVEC贴壁情况
图9 不同水凝胶表面HUVEC和HPAEpiC的覆盖率及活率
3.5 水凝胶薄膜的氧气传递性能
在微流控肺芯片构建过程中，氧气传递性能关系到血管内皮细胞是否能正常呼吸[39]。利用扩散池和溶解氧电极，测得纯F127-DA和Gel-MA/F127-DA (1/1)的O2如表2所示。其中，Gel-MA/F127-DA(1/1) 共聚水凝胶的O2为1.40´10-3cm2×min-1，与纯F127-DA水凝胶的O2相比较大，其原因在于Gel-MA的加入使F127-DA水凝胶呈现多孔结构(见图6)，从而使O2变大。
表2 水凝胶和肺的氧气扩散性能
肺泡的O2通常采用CO弥散来表征，文献报道的肺弥散系数co约为6.76 mL×(min×mmHg×L)-1，其含义为：单位肺容量下，单位时间、单位气体分压下通过弥散膜的气体体积[40-41]。基于单个肺泡是直径为0.2 mm的球的假设、且血液溶解氧过程符合亨利定律，可计算得到肺泡的O2约为0.56´10-3cm2×min-1。可见，F127-DA和Gel-MA/F127-DA (1/1)共聚水凝胶的O2与肺泡的接近，说明此类水凝胶是良好的肺基质替代材料。
以开孔的PET膜为支撑，制备Gel-MA/F127-DA共聚水凝胶薄膜，其平均厚度可达35 μm，并具有多孔结构。该水凝胶薄膜具有良好的力学性能，其杨氏模量为13.55 kPa，抗张强度为7.73 kPa，断裂延伸率为57.05%；
其对HUVEC和HPAEpiC细胞具有良好的相容性，且氧气传递性能良好，O2为1.40´10-3cm2×min-1。该水凝胶薄膜的各项性能均较为接近肺泡，为微流控肺芯片的仿生化构建提供了新的解决方案。
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Preparation and properties of hydrogel film for microfluidic lung-on-chips
YANG Hui-ming, SHEN Chong, MENG Qin
(College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)
The microfluidic lung-on-a-chip is a device for three-dimensional culture of lung cells. Its core component is a layer of polydimethylsiloxane (PDMS) porous film with high hardness, strong hydrophobicity and poor cytocompatibility. In order to better mimic alveoli, a hydrogel film based on methacrylylated gelatin (Gel-MA) and acrylated polyether F127 (F127-DA) was prepared to replace PDMS for construction of lung-on-chips. The results show that Gel-MA and F127-DA solutions of equal volume ratio are used to form a liquid film in the round holes of the polyethylene terephthalate (PET) film by surface tension, and the hydrogel film can then be prepared by UV-initiated copolymerization with average thickness of about 35 μm and porous three-dimensional network structure. The Young"s modulus of this hydrogel is 13.55 kPa, the elongation at break is 57.05%, and the mechanical properties can meet the needs of constructing lung-on-chips. In addition, the hydrogel film has good cytocompatibility with HUVEC and HPAEpiC cells. Meanwhile, oxygen diffusion coefficient of the hydrogel is 1.40´10-3cm2×min-1, which indicates good oxygen transmission performance. The properties of this hydrogel film are close to those of alveoli, and it can be used to construct new microfluidic lung-on-chips with physiology in consideration.
lung-on-chips; hydrogel film; mechanical property; cytocompatibility; oxygen transfer capability
1003-9015(2022)06-0886-08
TQ050.4
A
10.3969/j.issn.1003-9015.2022.06.014
2021-11-09；
2022-03-14。
国家自然科学基金(21978257)。
杨慧明(1996-)，男，河南新乡人，浙江大学硕士生。
孟琴，E-mail：mengq@zju.edu.cn
杨慧明, 沈冲, 孟琴. 面向微流控肺芯片的水凝胶薄膜制备及其性能研究[J]. 高校化学工程学报, 2022, 36(6): 886-893.
：YANG Hui-ming, SHEN Chong, MENG Qin. Preparation and properties of hydrogel film for microfluidic lung-on-chips [J]. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities, 2022, 36(2): 886-893.
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