田冰洁，殷令妮，张寅飞
卒中是世界范围内重要的公共卫生问题。虽然在一些发达国家和地区，卒中的发病率有所下降［1］。但在中国，卒中仍然是致死的首位原因，并导致严重神经功能缺损及残疾［2］。除高血压、糖尿病、肥胖、吸烟等危险因素，目前很多研究发现载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因型也与卒中风险相关。
由于存在两个单核苷段多态性位点，rs429358和rs7412，ApoE基因存在三种等位基因（ε2、ε3、ε 4），组成6种基因型（ε2∕ε2、ε2∕ε3、ε3∕ε3、ε2∕ε4、ε3∕ε 4、ε4∕ε4）［3］。三种等位基因在世界范围内分布不同，其中ε3最为常见，亚洲在85%左右，ε4在欧洲和亚洲的分布存在南北梯度，在我国南部地区＜10%，北部地区可以高达25%，ε2比例最低，约7.3%左右［4］。Wei等［5］纳入81项病例对照研究（29 506例病例和32 628例对照）的Meta分析结果表明ApoEε 4增加缺血性卒中风险（OR=1.58），而ApoEε3对缺血性卒中具有保护作用（OR=0.77）。Zhao等［6］对我国西北汉族缺血性卒中人群进行了TOAST（Trial of Org10172 in Acute Stroke Treatment）分型后的亚组分析，结果发现ε4等位基因（P=0.047，OR=1.61）及ε 4∕ε4基因型（P=0.017，OR=16.53）与大动脉粥样硬化性脑卒中（LAA）相关，ε2则对此型卒中具有保护性意义（P=0.044，OR=0.50，）；
ε4∕ε4基因也可增加小动脉闭塞性卒中的风险［P=0.028，OR=11.30，95%CI：（1.31，97.72）］，但在心源性卒中和其他原因所致卒中组中未发现ApoE基因多态性与其相关性。虽然很多研究发现ApoE基因型与缺血性卒中风险相关，但其具体的机制并未明确。一方面作为载脂蛋白参与脂质运输［7］，可影响动脉粥样硬化进程［8］。另一方面ApoE与神经炎症相关［9］，而神经炎症也是卒中重要的病理机制之一［10］，因而推测ApoE可能通过调节炎症反应参与卒中的病理进程。
本课题选择与ApoE基因型相关度较高的LAA人群，分析与卒中密切相关的白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-10［10］等炎性因子在不同ApoE基因型之间的差异，探讨ApoE基因多态性影响卒中的病理机制。
1.1 一般资料2018年10月至2020年5月上海健康医学院附属嘉定区中心医院收住首次缺血性卒中病人80例。入选标准：①符合1995年全国第四届脑血管病学术会议制订的脑梗死诊断标准［11］，且头颅磁共振证实有新发病灶；
②首次卒中，发病时间≤7 d；
③符合TOAST（trial of org10172 in acute stroke treatment）分型［12］中LAA诊断标准。排除标准：①其他类型的卒中：如小动脉闭塞性卒中（SAA）、心源性脑栓塞（CE）、其他原因所致的卒中（SOE）及病因未明的卒中（SUE）；
②急性感染，肝炎、结核等慢性炎症性疾病，肿瘤及自身免疫性疾病；
③近期应用抗生素及免疫抑制药物。对照组为无卒中史的健康体检者74例，且无上述疾病史及特殊用药史。入组病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。
入组卒中人群根据美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）评分，按照神经功能缺损程度分为（≤3分）、中（4～11分）、重（≥12分）三组［13］，轻度组33例，中度组38例，重度组9例。在头颅MRI的DWI序列上，根据Pullicino提出的公式［14］计算梗死灶体积，将入组卒中人群分为小梗死组（＜5 cm3）、中梗死组（5～15 cm3）、大梗死组（＞15 cm3）［15-16］，其中小梗死组34例，中梗死组31例，大梗死组15例。
1.2 实验室检测入组人群均于发病第7天清晨抽取空腹血，采用TIANamp Blood DNA Kit（DP348-02∕50 preps，TIANGEN公司）进行DNA提取，-20℃冻存。50 μL PCR扩增体系：1 μL DNA，1 μL引物（正向序列5"-GCCTACAAATCGGAACTGG-3"、反向序 列5"-CCTGCTCCTTCACCTCGTC-3"，上 海Sangon），1 μL脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP），5 μL Taq缓冲液，5 μL 25 mmol氯化镁（MgCl2），0.5 μL Taq脱氧核糖核酸（DNA）聚合酶（5 U∕μL）和35.5 μL水。94℃预变性3 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，72℃修复延伸5 min，循环35次，扩增ApoE基 因。ABI 3730xl DNA Analyzer（Sangon Biotech）进行基因测序。-80℃冻存血清，Procarta-Plex Human High Sensitivity Panel（9 plex，96 tests，eBioscience）试剂盒同时检测血清中检测血清IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17a、干扰素-γ（IFN-γ）、TNF-α水平。luminex 200读板记录数据。
1.3 统计学方法χ2检验或Fisher确切概率法对离散型变量两组间比较。连续性变量两样本资料采用t检验分析，多样本资料进行单因素方差分析；
连续性变量用±s表示；
logistic逐步回归分析各危险因素与卒中相关性。双侧P＜0.05认为差异有统计学意义（stata 10软件）。
入院人群基本信息见表1，两组间年龄、性别匹配，LAA组高血压的（P=0.041）比例显著高于对照组。
表1 入组人群基本信息
入组人群ApoE基因型分布见表2。与对照组相比，LAA组中ApoEε3∕ε4基因型（P=0.035）和等位基因ApoEε4比例（P=0.031）显著较高。对照组ApoE等位基因频率符合哈迪-温伯格平衡定律（P＞0.05）。logistic逐步回归矫正诸多混杂因素影响后，ApoEε4与LAA仍 显 著 相 关［P=0.020，OR=2.94，95%CI：（1.18，7.32）］，此外高血压也与LAA显著相关［P=0.005，OR=2.80，95%CI：（1.38，6.12）］见表3。
表2 大动脉粥样硬化性脑卒中（LAA）组及对照组ApoE基因型分布∕例（%）
表3 logistic逐步回归分析LAA危险因素
Luminex检测血清IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17a、IFN-γ、TNF-α水平。如表4所示，LAA组血清IL-1β（t=2.02，P=0.046）、IL-6（t=2.43，P=0.017，）、TNF-α（t=3.18，P＜0.001）水平显著高于对照组，IL-10显著低于对照组（t=2.10，P=0.038）。
表4 LAA组与对照组炎性因子水平∕（ng∕L
表4 LAA组与对照组炎性因子水平∕（ng∕L
注：IL为白细胞介素，IFN-γ为干扰素，TNF-α为肿瘤坏死因子-α。
组别对照组LAA组t值P值例数74 80 IL-1β 0.76±0.11 1.22±0.19 2.02 0.046 IL-2 7.92±0.40 8.23±0.90 0.31 0.757 IL-4 72.82±8.47 58.02±7.92 1.28 0.203 IL-6 7.37±1.83 14.90±2.46 2.43 0.017 IL-10 2.31±0.38 1.46±0.15 2.10 0.038 IL-12p70 1.17±0.19 1.39±0.24 0.72 0.474 IL-17a 14.05±7.20 22.10±6.07 0.86 0.391 IFN-γ 24.43±4.01 29.95±7.29 0.65 0.517 TNF-α 2.34±0.36 5.18±0.79 3.18 0.002
比较不同程度神经功能缺损LAA人群的血清炎症水平差异，见表5所示，重度神经功能缺损组IL-1β水平显著高于轻度组（P=0.004）和对照组（P＜0.001），中度组IL-1β水平显著高于对照组（P=0.039）。重度组IL-6水平显著高于轻度组（P=0.003）及对照组（P＜0.001），中度组IL-6水平显著高于对照组（P=0.030）。重度组TNF-α水平显著高于轻度组（P＜0.001）和对照组（P＜0.001），中度组TNFα水平亦显著高于对照组（P=0.001）。神经功能缺损较为严重的人群，呈现较高的炎症水平。
表5 LAA后不同程度神经功能缺损血清炎性因子水平∕（ng∕L
表5 LAA后不同程度神经功能缺损血清炎性因子水平∕（ng∕L
注：IL为白细胞介素，IFN-γ为干扰素，TNF-α为肿瘤坏死因子-α。
组别对照组轻度NIHSS≤3中度NIHSS 4～11重度NIHSS≥12 F值P值例数74 33 38 9 IL-1β 0.76±0.11 0.76±0.10 1.25±0.25 2.74±1.21 7.20＜0.001 IL-2 7.92±0.40 7.78±0.54 8.10±1.46 10.48±4.90 0.48 0.696 IL-4 72.82±8.47 51.69±8.35 62.08±14.63 64.05±16.53 0.68 0.563 IL-6 7.37±1.83 9.80±2.64 15.67±3.88 31.45±8.78 5.32 0.002 IL-10 2.31±0.38 1.57±0.15 1.49±0.29 0.97±0.22 0.80 0.496 IL-12p70 1.17±0.19 1.01±0.18 1.43±0.37 2.61±1.27 1.92 0.129 IL-17a 14.05±7.20 20.78±5.80 26.63±11.77 7.81±1.19 0.52 0.669 IFN-γ 24.43±4.01 25.18±6.30 34.57±14.20 27.95±11.16 0.67 0.570 TNF-α 2.34±0.36 2.91±0.73 5.69±1.25 11.32±3.12 9.99＜0.001
表6比较了LAA人群不同梗死灶体积之间血清炎症水平，结果发现大梗死组IL-1β水平显著高于小梗死组（P=0.001）和对照组（P＜0.001）。中梗死组IL-6水平显著高于小梗死组（P=0.044）、及对照组（P=0.003）。大梗死组IL-12p70水平显著高于小梗死组（P=0.032）及对照组（P=0.019）。大梗死组TNF-α水平显著高于小梗死组（P＜0.001）和对照组（P＜0.001），中梗死组TNF-α水平亦显著高于小梗死组（P=0.044）及对照组（P=0.003）。梗死灶较大的人群呈现较高的炎症水平。
表6 LAA后不同病灶大小血清炎性因子水平∕（ng∕L
表6 LAA后不同病灶大小血清炎性因子水平∕（ng∕L
注：IL为白细胞介素，IFN-γ为干扰素，TNF-α为肿瘤坏死因子-α。
组别对照组小梗死＜5 cm3中梗死5～15 cm3大梗死＞15 cm3 F值P值例数74 34 31 15 IL-1β 0.76±0.11 0.74±0.09 1.31±0.38 2.11±0.57 4.35 0.006 IL-2 7.92±0.40 7.55±0.62 8.16±1.75 9.93±2.88 0.53 0.660 IL-4 72.82±8.47 49.01±4.61 66.05±17.89 61.85±18.26 0.86 0.463 IL-6 7.37±1.83 9.19±2.59 20.23±4.89 16.84±5.67 3.89 0.010 IL-10 2.31±0.38 1.64±0.16 1.54±0.34 0.92±0.14 1.76 0.158 IL-12p70 1.17±0.19 1.00±0.17 1.19±0.22 2.67±1.08 3.22 0.025 IL-17a 14.05±7.20 16.40±9.02 24.45±11.13 29.96±10.76 0.46 0.710 IFN-γ 24.43±4.01 23.06±7.29 36.87±16.25 31.28±11.44 0.51 0.675 TNF-α 2.34±0.36 2.49±0.60 5.61±1.45 10.38±2.13 12.03＜0.001
进一步分析在LAA人群中中ApoE基因型对血清水平的影响（表7）。结果表明，ApoEε4+组血清IL-6（t=2.30，P=0.024）、IL-12p70（t=2.01，P=0.049）水平高于ApoEε3∕ε3组，TNF-α（t=2.66，P=0.012）水平显著高于ApoEε2+组；
而ApoEε4+（t=3.56，P=0.001）和ApoEε3∕ε3组（t=2.13，P=0.038）IL-10水平则显著低于ApoEε2+组。
表7 LAA人群ApoE基因型之间血清炎症水平差异∕（ng∕L
表7 LAA人群ApoE基因型之间血清炎症水平差异∕（ng∕L
注：IL为白细胞介素，IFN-γ为干扰素，TNF-α为肿瘤坏死因子-α。
组别ApoEε2+ApoEε3∕ε3 ApoEε4+F值P值IL-1β 1.54±0.42 0.98±0.18 1.52±0.5 1.03 0.363 IL-2 6.45±0.51 7.65±1.11 10.60±2.11 1.41 0.251 IL-4 63.66±22.96 57.15±11.16 67.22±14.33 0.14 0.868 IL-6 9.79±5.77 12.39±3.00 25.88±5.58 3.20 0.046 IL-10 2.34±0.31 1.34±0.22 1.28±0.14 3.13 0.049 IL-12p70 1.79±0.58 1.05±0.22 2.16±0.68 2.24 0.113 IL-17a 7.20±0.94 21.89±9.00 29.18±8.63 0.64 0.528 IFN-γ 56.33±40.60 20.57±3.63 23.01±7.12 1.87 0.160 TNF-α 2.01±0.42 4.59±0.99 8.15±1.72 3.53 0.034
由于既往有研究表明高血压与炎症也相关，为了排除高血压作为混杂因素的影响，比较LAA组不同ApoE基因型高血压人群的分布，ε2+有8例（66.7%），ε3∕ε3有35例（70.0%），ε4有13例（61.9%），三组之间差异无统计学意义（χ2=0.45，P=0.800）。
本研究发现LAA组中ApoEε3∕ε4基因型和等位基因ApoEε4分布比例显著高于对照组。logistic逐步回归矫正诸多混杂因素影响后，ApoEε4与LAA显著相关。Sudlow等［17］对31项研究进行Meta分析，结果表明相较于白人或其他人群，亚洲人群中ε4与缺血性卒中呈现较高的相关性，且ε4与大血管性卒中的相关度较高［OR95%CI：1.33（0.99，1.78）］，而在小动脉性卒中、心源性卒中及原因不明的卒中等亚型中未发现相关性。Kumar等［18］入组了250例来自北印度卒中病例，研究结果也表明ApoEε4与大血 管 性 卒 中 风 险 相 关［OR=2.57，95%CI：（1.72，3.85），P=0.001］。上述研究与我们的研究结果类似。但也有一些研究得出不一致的结论，比如希腊Chatzistefanidis等［19］的研究入组了329例首次缺血性卒中的病人，仅在女性人群中发现ε3∕ε3对于卒中具有一定的保护意义中［OR95%CI：0.67（0.48，0.95）］。来自印度南方人群中的一项研究分析不同卒中亚型的ApoE基因型分布，结果发现与对照组相比，在颅内LAA组中ε4的分布显著较低，ε3显著较高［P=0.01，OR=1.6，95%CI：（1.1，2.4）］，与我们的研究结果相反［20］。其原因可能是入组人群的种族、数量及研究方法等方面差异。此外在本研究中还发现高血压也与LAA显著相关，但其他危险因素如糖尿病、吸烟史、BMI、血脂等未发现与LAA相关性，可能由于样本量较小的原因。
炎症应答在缺血性卒中的病理进程中发挥着重要的作用。急性血管闭塞后，缺血的脑组织及免疫细胞释放活性氧，激活内皮血管内皮细胞，造成氧化应激及炎症瀑布样反应［21］。血脑屏障（BBB）破坏，中性粒细胞、T细胞等血源性细胞浸润及小胶质细胞激活［22］，激活的小胶质细胞一方面吞噬坏死组织、细胞碎片，另一方面释放TNF-α、IL-6等促炎因子以及活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）等，进一步加重氧化应激［23］，此外，缺氧和氧化应激可诱导NFκB、缺氧诱导因子1（HIF1）等转录因子合成，增加一系列促炎和抗炎因子的表达［24］。这些炎性因子还可以促进内皮细胞表达黏附分子，募集更多的外周白细胞，正反馈促进更多炎性因子合成，最终通过与相应的炎性因子受体相作用，激活凋亡信号通路，促进神经元死亡，造成梗死灶面积扩大，加重神经功能缺损。Basic等［25］研究发现急性缺血性卒中12 h内，卒中组促炎因子IL-6水平为8（4，21）ng∕L，显著高于对照组8（4，21）ng∕L，而抗炎因子IL-10水平为13.5（6.9，20.9）ng∕L，显著低于对照组21.5（12.4，27.5）ng∕L，两组间TNF-α水平无明显差别。Ormstad等［26］的研究表明急性缺血性卒中人群血清IL-1ra、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-18及CXCL1水平显著升高，IL-1β、IL-2、IL-4、TNF-α无明显变化。与上述结果类似，本研究也发现LAA组血清IL-1β、IL-6、TNF-α显著高于对照组，IL-10显著低于对照组。也有研究发现卒中人群TNF-α水平升高，并且与梗死灶体积［27］，NIHSS评分呈正相关［28］。本研究也发现重度神经功能缺损组或者梗死灶较大的LAA人群呈现较高的IL-1β、TNF-α等炎性因子水平，表明炎症反应强度与病情严重程度及梗死体积相关，再次证明炎症应答促进卒中的病理进程及病情进展。
虽然ApoE与缺血性卒中相关，但其具体机制并未明确。ApoE是299个氨基酸的糖蛋白，存在E2、E3和E4三种亚型，其区别在于112和158位氨基酸残基不同［29］。这些区别会影响ApoE对脂蛋白选择性及其与相应受体结合的敏感性，造成血脂水平不同，从而影响动脉粥样硬化的风险［7］。此外，目前许多研究发现ApoE与神经炎症相关，从整体上看，ApoE是抑制炎症应答的［30］。将小鼠的单核-巨噬细胞系与人类重组ApoE共培养，再分别用脂多糖（LPS）和聚肌苷-聚胞苷酸（Poly I∶C）刺激，结果显示相较于未用ApoE处理的对照组，实验组细胞IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌水平显著降低，而且呈现ApoE剂量依赖性［31］。Li等［32］的研究发现ApoE可以通过增强单核和巨嗜细胞miR-146a水平抑制NFκB介导的炎症反应。但ApoE不同基因型对炎症应答的影响不同。Gale等［33］抽取基因型ApoEε3∕ε4及ApoEε3∕ε3健康志愿者的外周血，然后分别和热灭活的单核细胞细胞增多性李斯特菌、LPS等共同孵育，ApoEε3∕ε4组TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、IFN-γ、MIP-1α等细胞因子水平显著较高。Maezawa等［34］将人类ApoE靶向替换（ApoE-TR）小鼠的小胶质细胞暴露 于LPS 12 h后，IL-6、TNF-α等 的 分 泌水 平ApoE4-TR＞ApoE3-TR＞ApoE4-TR。分别直接向人类ApoE-TR和ApoE基因敲除（KO）小鼠脑室内注射LPS，与ApoE2-TR、ApoE3-TR相 比，ApoE-KO和ApoE4-TR小鼠海马的小胶质细胞、星形胶质细胞呈现较高的活化水平，且海马组织中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6分泌水平也高于其余两组，表明在CNS中ApoE4抗炎作用减弱，因而呈现较高的炎症水平［35］。
综上所述，ApoE参与炎症应答，且神经炎症是缺血性卒中重要的病理机制，推测ApoE可能也通过调节神经炎症参与缺血性卒中的病理进程。本研究 发 现LAA组中ApoEε4+人 群 血 清IL-6、IL-12p70水平高于ApoEε3∕ε3人群，TNF-α水平显著高于ApoEε2+人群；
而ApoEε4+和ApoEε3∕ε3人群IL-10水平则显著低于ApoEε2+人群，表明ApoEε4呈现较高炎症水平，而ApoEε2基因型炎症水平相对较低，与上述基础研究结类似。其余的炎性因子在不同基因型之间差异无统计学意义，其原因一方面可能是缺血性卒中急性期，血清中不同炎性因子水平发生改变的时间不同，另一方面可能与炎性因子、免疫细胞等相互作用相关。
另外由于既往有研究表明炎症反应也是高血压的病理机制之一，TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP等炎症标志物在高血压人群中也有显著升高［36-37］，为了排除高血压作为混杂因素的影响，我们还比较了LAA组不同ApoE基因型高血压人群的分布，确定三组之间高血压分布差异无统计学意义。
目前在卒中人群中分析ApoE基因型对血清炎症标志物影响的研究较少，也是本课题的创新之处。仅有韩国的一项研究发现缺血性卒中ApoEε2携带人群MMP-9水平（181.8±215.8）μg∕L显著高于非ApoEε2携带人群（103.0±106.2）μg∕L［38］。在其他疾病模型中，如在冠心病发现ApoEε4与较低的IL-10水平相关［39］，ApoEε4+阿尔茨海默病病人外周血单个核细胞分泌的IL-1β显著较高［40］。从上述研究可以看出，目前关于ApoE基因型对血清炎症水平影响的研究结论并不一致，且以缺血性卒中为模型的研究较少，进一步探究有助于深入了解ApoE与卒中相关的病理机制，探索干预的靶点。
本研究依然有不足之处，一方面是样本量较小；
另一方面，虽已经排除急性感染、免疫系统疾病等影响炎症水平的疾病，但潜伏期感染、个人合并症及免疫基础不同，造成炎性因子水平的变异较大，也会引起结果的偏差。此外，目前为横断面研究，可进一步动态随访卒中恢复期血清炎性因子的变化，探讨ApoE基因型与卒中预后及血清炎症水平三者之间相关性。
本研究中ApoEε4是LAA重要的危险因素，ApoEε4+人群呈现较高炎症水平，表明ApoE可能通过参与炎症应答在缺血性卒中病理进程中发挥重要的作用。
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