金红梅,张 亮
吉林省龙井市智新镇综合服务中心，吉林龙井 133400
1.1 精子可结合外源DNA
1944年Avery,Macleod和McCarty发现了DNA是遗传信息的遗传库，而不是蛋白质[1]。1953年Watson和Crick提出了DNA是双螺旋结构，这些影响了现代生物学的方向，并为当前基因组学研究的暴发提供了基础。动物体的遗传性状和细胞特性都可以通过在细胞内转移外源DNA片段来修饰。利用外源DNA对细胞性状进行基因修饰的实验反映了自然界中目前存在的一种称为水平或横向基因转移的现象，它包括遗传信息跨越远亲生物（如真核生物和低等真核生物）之间的交配障碍的传递，随着不断地研究，动物中也有报道[2]。
在众多已被证明可接受转染的细胞中，成熟的精子一直是一个例外。精子细胞在基因传递实验中没有被测试为可能的受体细胞，甚至在理论上也没有被认为是外源DNA传染的合理候选者。这种先入为主的排斥长期以来一直没有受到科学界的质疑，但后来被认为是一种不需要实验证明就能解释的证据，即精子是高度紧凑的细胞、代谢缓慢、外源分子几乎无法穿透。这种观点是由于精子与其它体细胞在细胞形态上截然不同导致的，这种形态上的不同包括：提供运动能力的长管状鞭毛，其内几乎完全无细胞质、高度浓缩的染色质组织紧密包裹在精子头部的核-精蛋白复合体。这些独特的结构特征似乎与复杂的生物化学功能或细胞活动不相容，这导致了精子是代谢缓慢细胞的想法[3]。其独特的和唯一的功能是受精过程中传递父系基因组。随着对精子细胞深入研究，应用微球菌和胰腺核酸酶消化法处理海胆精子染色质组织中发现，无论是使用基于细胞核分离的经典方案，还是通过简单地将核酸添加到缓冲的海水中（完整的精子具备活性），染色质裂解都能同样良好地产生，在后一种情况下，精子迅速停止移动，DNA提取后，产生经典的核小体。这些观察结果表明，在没有任何处理精子的情况下，添加到培养基中的核酸酶能够穿过血浆和核膜，并获得活精子的染色体DNA。
1.2 精子具有结合外源DNA的能力
尽管精子的转录状态明显是惰性的，但它实际上储存了大量的异质RNA种群，其中包括数前信使RNA和micRNA。成熟精子中转录序列的鉴定与异质RNA也存在转录因子集合的发现是一致的，这种RNA的一部分被认为是通过线粒体核糖体装备在精子细胞内，另一部分则是在受精时被传递到卵母细胞中，这意味着精子对合子的贡献不限于父代的基因组，还包括基本的RNA细胞[4]。事实上，现在人们已经承认受精过程中精子在遗传信息的传递过程中扮演者重要的作用及角色。例如，发现精子RNA分子可介导小鼠表观遗传性状的非孟德尔遗传，就引出了这种复杂的作用。此外，精子内源性逆转录酶依赖机制可以在整个发育过程中产生和繁殖具有转录能力的逆转录基因。
转基因动物：是指应用特定的转基因方法改变动物遗传信息进而导致表观特征的发生改变。现今，转基因动物广泛的应用于临床疾病的诊治及药物的开发中，小鼠作为临床上应用最为广泛及常见的动物模型，有着诸多的局限性。例如，寿命、体型、生理及病理特性和组织结构等。而猪和牛作为大型哺乳类动物，在生理及病理学上更加接近人，为人类疾病的研究及诊治提供了更好的生物模型。因此开发出稳定便捷高效的转基因技术，生产出大型转基因哺乳动物可进一步了解疾病的发病机理及机制，为治疗提供了有效的动物模型。
SMGT是基于精子在受精过程中结合、内化和转运外源DNA到卵母细胞的能力。研究表明，精子可自发的与外源DNA结合并将其转运到卵母细胞，后代可表达外源DNA。SMGT或多或少的参与了转基因胚胎和动物的生产，虽然已经使用SMGT获得了转基因动物，但这种技术的重复性极低[5]。此外，外源性DNA在精子内结合和转化的机制、受精时的传播方式及外源DNA在胚胎、胎儿和后代中的持久性，这些问题尚未完全阐明。
2.1 精子介导转基因牛的生产
在转基因牛的生产中，外源性DNA可与精子结合，应用SMGT技术可繁育出转基因胚胎或犊牛，但外源性DNA与精子的结合和内化机制尚不明确，且生产出转基因动物的效率极低、相关研究结论差异较大。为增加介导效率及探究作用机制，人们应用电穿孔转染、化学转染试剂（脂质体、FuGene6）方法来增加外源DNA进入精子的吸收和融和能力。Gagne等应用电穿孔转染方法增强了外源DNA进入牛精子的能力，且使质粒结合的百分比增加了5倍。Rieth等也得出了相似的结果，但发现电穿孔转染后精子活力明显下降。Hoelker等研究表明，脂质体处理并不能提高精子结合外源DNA的能力，但应用FuGene6可显著提高结合能力。但也有报道表明，脂质体或FuGene6均能提高转染率，这两种不同的处理方法对卵裂率和囊胚率均无影响，尽管应用FuGene6时，转染率提高了7～8倍。根据以上结果表明，精子质膜的脂质结构可能影响外源DNA的结合。
在已经确认影响SMGT效率的因素中。已知哺乳动物的精浆可阻断外源DNA的结合，附睾精子与牛精子的结合比例较高。有报道指出，液氮保存牛精子在解冻后结合外源DNA的效果高于新鲜精子，这直接导致了低温保存诱导质膜发生变化的假说，从而促进了外源DNA的结合和内化。应用流失细胞仪检测了牛精子结合外源DNA能力和活力动态，这使我们能够确定携带外源DNA牛活精子数量，这些精子可以在传统的体外受精或人工智能系统中使卵母细胞受精。这些研究表明，一部分精子可以结合外源DNA（大约15%的精子群体具备这种能力）。在结合能力研究表明，精子与外源DNA的结合可能需要超过30 min的孵育时间。然而在牛精液能更快地结合外源DNA，这个过程在30 min内完成。这些结果表明，在授精前与外源DNA进行长时间的孵育并不是获得最大受精结果的必要条件，特别是考虑到长时间的孵育会对精子活力产生负面影响。精子在与外源DNA的结合能力上，雄性精子之间观察到显著的差异。目前外源DNA对精子功能的影响尚不明确。运动性是精子的一种特殊特性，它对精子的生物学功能是绝对必要的。假设DNA结合对运动的负面影响可以解释许多SMGT的失败。之前的研究报道了与DNA效果相反的结果，已有研究报道指出牛精子与外源DNA结合后，精子运动参数曲线速度、直线速度、平均路径速度、曲线轨迹的线性都等均降低。
2.2 精子介导转基因猪的生产
近年来，转基因猪已成为生物医学研究的重要工具，例如异种器官移植研究及人类疾病动物模型等。但目前转基因动物的生产主要依赖原核显微注射、病毒载体及核移植技术，这些方法均需要昂贵的设备及熟练的技术，在大型农场中使用的效率极低。因此应用SMGT在大型农场生产转基因动物是未来发展的方向。Gandolfi等在1989年首次在猪中应用了SMGT技术，并在生产的子代中检测出了外源DNA表达。但往后的子代中并无转基因动物。而Sperandio等表明通过人工授精技术，将应用SMGT方法携带外源DNA的精子注入母猪中，在动物胚胎中有0%～5.7%具有转基因，且转基因动物基因可稳定遗传。Lavitrano等也通过人工授精导入通过SMGT处理的精液生产出了转基因动物，但在70～90 d过后外源DNA消失，他们猜测这是由于胎儿发育早期阶段对DNA进行了修复。
几种因素可以决定使用该技术的成功率，包括猪供体、使用的结构物、培养基等，这种技术的效率取决于所使用的结构类型和DNA数量。因此，Sciamanna等在2000年报道称，大于50～100 ng DNA/106个精子会对胚胎产生致命的影响，并减少人工授精后产仔数量。众所周知，外源DNA的存在会对精子功能产生毒性作用。但在其他的研究中发现，精子与外源DNA的孵育并不涉及精子参数的改变。这种不同结果的产生需要更多的研究进行验证并证明。
转基因动物的生产对人类疾病的诊治及药物开发具有重要意义，且对畜牧业动物的发展具有促进作用。目前生产转基因动物所需的技术过于繁琐且价格昂贵，在大型牧场应用率极低。而应用SMGT来生产转基因动物具有明显的优势，是未来生产转基因动物发展的方向。
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