武怀恒，向礼波，李文静，许敏，姜理涛，许冬，丛胜波，万鹏
（农业农村部华中作物有害生物综合治理重点实验室/农作物病虫草害防控湖北省重点实验室/湖北省农业科学院植保土肥研究所，湖北武汉 430064）
【研究意义】草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）隶属鳞翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），原发生于美洲热带和亚热带地区，是一种分布广泛的世界性农业害虫（Montezano et al.，2018）。草地贪夜蛾具有迁飞习性，其扩散速度快，且对作物危害严重。据欧洲地中海植物保护组织和亚洲各国发布的信息，截至2019年1月，草地贪夜蛾已在全球100多个国家分布（王磊等，2019）。草地贪夜蛾的入侵对我国农业生产和粮食安全造成严重威胁（杨普云等，2019）。草地贪夜蛾以幼虫取食玉米叶片、叶心和果穗等对玉米直接危害（洪鼎剀等，2021），并造成镰孢菌和黄曲霉等微生物从受害部位侵入植株，产生毒素，造成玉米产量、质量下降（梁沛等，2020）。目前，有关化学杀虫剂防治草地贪夜蛾的研究较多，并且在生产上化学农药亦是防治该虫的主要手段（赵胜园等，2019；
关秀敏等，2021）。在草地贪夜蛾不断扩散和暴发为害的趋势下，大量使用化学农药并非防控害虫的长久之计，必须寻求其他防控手段以减少或替代化学农药，以实现草地贪夜蛾的可持续治理。生物防治作为害虫绿色防控的重要组成部分，对农业可持续发展、食品安全保障等提供了物质基础和技术支撑。病原微生物杀虫剂作为一类生物农药，具有能持续控制害虫、对环境友好且不易引起害虫产生抗性等优点，在害虫防治中发挥着重要作用。短稳杆菌（Empedobacter brevi）是一种从感病斜纹夜蛾（Spodoptera litura）体内分离的病原微生物，其作用机理是通过昆虫取食进入虫体并大量繁殖，在生长发育过程中产生蛋白质毒素，干扰虫体新陈代谢，从而杀死昆虫（赵磊等，2017）。研究短稳杆菌对草地贪夜蛾的杀虫活性及其对解毒酶活性的影响，对于减少化学农药使用、高效绿色防控草地贪夜蛾具有重要意义。【前人研究进展】草地贪夜蛾的入侵，导致我国防治该虫的化学农药使用量大幅增加。有学者研究发现，草地贪夜蛾入侵云南后，玉米田化学农药总使用量显著增加，施用次数由2.1次增加至6.4次（Yang et al.，2021）。然而，化学杀虫剂的大量不规范使用极易导致草地贪夜蛾产生抗药性。田间抗性监测研究报道，草地贪夜蛾部分种群对常用化学防治药剂有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类农药已达中至高等水平抗性（王芹芹等，2019；
赵胜园等，2019；
Zhang et al.，2021），对甲维盐和氯虫苯甲酰胺等新型农药表现出中低水平抗性（苏湘宁等，2020）。生物农药具有安全高效、选择性强、不易对环境造成污染等优点，害虫防治中使用生物农药可减缓害虫对化学杀虫剂抗药性增强，同时减少化学农药使用量，是农药发展的方向（颜成生等，2015）。短稳杆菌作为新型的生物农药对多种鳞翅目及双翅目害虫具有良好的杀虫活性。相关研究发现，短稳杆菌对大豆卷叶螟（Lamprosema indicata）和茶尺蠖（Ectropis oblique）均有很好的室内杀虫效果（关成宏等，2016；
姚惠明等，2017），不仅如此，短稳杆菌对田间害虫也有优良的防治效果，其对水稻田二化螟（Chilo suppressalis）、玉米田黏虫（Mythimna seperata）、烟草上的烟青虫（Heliothis assulta）、大棚内黄瓜上的美洲斑潜蝇（Liriomyza sativae）等防治效果均可达80%以上，与化学药剂相当（吴铭忻等，2016；
孙剑华等，2018；
王义生等，2018；
迟腾和纪祥龙，2020）。昆虫可凭借生理、生化防御机制来抵御杀虫剂及其他外源或内源有害物质（Zhang et al.，2017；
李长春等，2019；
鲁智慧等，2020）。在自身防御机制中，昆虫可利用解毒酶系来进行解毒和排毒（Felton and Tumlinson，2008）。昆虫体内的主要解毒酶谷胱甘肽S-转移酶（GST）和羧酸酯酶（CarE），以及乙酰胆碱酯酶（AChE）均参与外源有毒物质的分解和代谢（Yang et al.，2013；
张鑫乾等，2014）。【本研究切入点】目前，国内有关生物农药对草地贪夜蛾解毒酶活性的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】测定短稳杆菌对草地贪夜蛾幼虫的室内毒力与田间防效，并检测短稳杆菌处理后草地贪夜蛾幼虫体内GST、CarE和AChE活性变化，以明确短稳杆菌对草地贪夜蛾的杀虫活性及其解毒酶的影响，为草地贪夜蛾的高效绿色防控提供理论依据。
1.1 试验材料
1.1.1 供试昆虫.供试草地贪夜蛾在实验室用人工饲料饲养。室内杀虫活性测定试验时，分别选择个体大小一致且健康的1、2和3龄幼虫。
1.1.2 供试药剂100亿孢子/mL短稳杆菌悬浮剂（SC）（江苏省镇江市润宇生物科技公司生产）；
0.5%苦参碱水剂（SL）（江苏省南通神雨绿色药业有限公司生产）；
200 g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂（SC）（美国杜邦公司生产）。
1.2 试验方法
1.2.1 室内杀虫活性测定.采用叶片浸渍法测定。试验药剂短稳杆菌设置为1.00×108、1.00×107、5.00×106、2.50×106、1.25×106孢子/mL等5个梯度浓度处理，以清水处理为对照。用剪刀将玉米嫩叶剪至5 cm大小，然后在不同药剂处理中浸10 s后取出并晾干，放入直径为9 cm的塑料培养皿中，接入大小一致已饥饿2 h的草地贪夜蛾幼虫；
其中1和2龄幼虫每培养皿接入10头、3龄幼虫每培养皿接入5头。每处理重复3次，每重复接虫30头左右。将以上处理置于光照培养箱内，设置温度（27±1）℃、湿度（70±5）%、光周期L∶D=14 h∶10 h，药后72 h检查不同处理的死虫数，计算死亡率。
1.2.2 田间药效试验.采用喷雾法测定。选择受草地贪夜蛾中度为害的玉米田进行试验，幼虫多为2~3龄，玉米生育期为小喇叭口期。短稳杆菌悬浮剂对斜纹夜蛾推荐杀虫用药量为800~1000倍液，即孢子浓度1.25×107~1.00×107孢子/mL，据此设以下5个处理：（1）100亿孢子/mL短稳杆菌悬浮剂800倍液；
（2）100亿孢子/mL短稳杆菌悬浮剂1000倍液；
（3）0.5%苦参碱水剂800倍液；
（4）200 g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂2000倍液；
（5）空白对照。试验采用随机区组排列，每小区面积60 m2，不同药剂处理区间隔2 m，每处理4次重复。
调查方法：参考高庆远等（2021）方法，按照Z字型进行草地贪夜蛾幼虫调查，每点调查10株玉米，每小区5点共计50株，每处理调查200株，并做好标记。分别于施药前、施药后3、5、7 d调查草地贪夜蛾幼虫数量，计算虫口减退率及防治效果。虫口减退率（%）=（药前活虫数-药后活虫数）/药前活虫数×100；
防治效果（%）=（处理区虫口减退率-对照区虫口减退率）（/100-对照区虫口减退率）×100。
1.2.3 解毒酶和AChE活性测定.用短稳杆菌亚致死剂量对草地贪夜蛾室内种群进行处理，48 h后测定未死亡草地贪夜蛾的CarE、GST和AChE活性。
1.2.3 .1 短稳杆菌亚致死剂量处理.根据1.2.1试验结果分别得出草地贪夜蛾1、2和3龄幼虫的亚致死剂量（LC20），以亚致死剂量分别处理幼虫，方法同1.2.1，48 h后取活虫制备酶液。
1.2.3 .2 酶活性测定.参考徐伟等（2018）的方法，将草地贪夜蛾幼虫称重，每0.1 g虫体加入1 mL提取液，冰浴下匀浆，8000 r/min离心10 min，取上清液待测。根据CarE、GST和AchE试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）说明书步骤利用酶标仪分别测定CarE、GST和AChE活性。每组样品3次重复。
1.3 统计分析
采用Excel 2010进行统计和整理死亡率、校正死亡率、虫口减退率、防治效果、解毒酶及AChE活性；
采用SPSS 20.0计算毒力回归方程和半数致死浓度（LC50）、LC20及其95%置信区间，并用邓肯氏新复极差法对虫口减退率和防治效果进行差异显著性分析。
2.1 短稳杆菌对草地贪夜蛾的室内杀虫活性
短稳杆菌对草地贪夜蛾幼虫的室内杀虫活性测定结果（表1）显示，短稳杆菌对草地贪夜蛾1~3龄幼虫均具有较好的毒杀作用，浓度分别为1.00×108、1.00×107、5.00×106、2.50×106和1.25×106孢子/mL时草地贪夜蛾1龄幼虫的校正死亡率分别为96.55%、86.21%、55.17%、36.21%和24.14%，LC50与LC20分别为3.32×106和9.15×105孢子/mL；
2龄幼虫的校正死亡率分别为94.92%、83.05%、62.71%、32.20%和23.73%，LC50与LC20分别为3.51×106和9.98×105孢子/mL；
3龄幼虫的校正死亡率分别为78.33%、58.33%、43.33%、31.67%和16.67%，LC50与LC20分别为9.14×106和1.02×106孢子/mL。
表1 短稳杆菌对草地贪夜蛾的室内杀虫活性Table 1 Indoor insecticidal activity of E.brevis to S.frugiperda
2.2 短稳杆菌对草地贪夜蛾的田间药效
由表2可看出，药后各药剂处理的虫量均较处理前大幅下降。药后3 d，短稳杆菌800和1000倍液、氯虫苯甲酰胺2000倍液对草地贪夜蛾均表现出良好的杀虫活性，防效均在80.00%以上；
苦参碱800倍液的效果较差，防效仅为58.20%；
分析不同药剂处理间防效的差异性发现，短稳杆菌800和1000倍液与氯虫苯甲酰胺2000倍液差异不显著（P＞0.05，下同），但均显著高于苦参碱处理（P＜0.05，下同）。药后5 d，短稳杆菌800和1000倍液、氯虫苯甲酰胺2000倍液的防效均达90.00%以上，显著高于苦参碱800倍液处理。药后7 d，短稳杆菌800和1000倍液、苦参碱800倍液及氯虫苯甲酰胺2000倍液的防效分别为95.84%、93.78%、85.37%、91.70%，短稳杆菌800和1000倍液的防效稍高于氯虫苯甲酰胺2000倍液处理，但差异不显著；
短稳杆菌800和1000倍液、氯虫苯甲酰胺2000倍液的防效显著高于苦参碱处理。整体结果表明，短稳杆菌800和1000倍液处理后3 d对草地贪夜蛾即有明显的防治效果，药后7 d达到最高水平。
表2 短稳杆菌对草地贪夜蛾的田间防治效果Table 2 Field control effect of E.brevis on S.frugiperda
2.3 短稳杆菌对草地贪夜蛾解毒酶和AChE活性的影响
由图1-A可看出，短稳杆菌LC20剂量处理后草地贪夜蛾1、2和3龄幼虫的GST活性分别为2.58、2.07、1.96 U/g，分别下降至对照的77%、64%和73%，可见短稳杆菌对草地贪夜蛾幼虫体内GST活性有明显的抑制作用。
由图1-B可看出，短稳杆菌LC20剂量处理后草地贪夜蛾1、2和3龄幼虫的CarE活性分别为4.47、2.29、3.13 U/g，分别下降至对照的77%、49%和67%，可见短稳杆菌对草地贪夜蛾幼虫体内CarE活性有明显的抑制作用。
由图1-C可看出，短稳杆菌LC20剂量处理后草地贪夜蛾1、2和3龄幼虫的AChE活性分别为2714.28、3468.79、2350.2 U/g，分别下降至对照的69%、98%和75%，可见短稳杆菌对草地贪夜蛾幼虫体内AChE活性有明显的抑制作用。
图1 短稳杆菌亚致死剂量（LC20）处理后草地贪夜蛾幼虫体内解毒酶和AChE活性Fig.1 Detoxification enzyme and ACh Eactivity of S.frugiperda after sublethal concentration（LC20）of E.brevis treatment
农药在农作物病虫害防治中具有重要作用，但随着现代社会对食品安全、生态和环境安全意识的提高，人们认识到化学农药的大量使用会造成病虫害抗性、再猖獗和残留等问题（王永强等，2019）。生物农药由于具有低毒、低残留、环境友好和不易产生抗药性等特点而日益受到重视（邱德文，2015）。草地贪夜蛾是玉米田的重要害虫，随着防治面积和防治频率的不断增大，该虫已对部分化学农药产生抗性，当前选用生物农药进行防治十分必要。作为新型的生物农药，关于短稳杆菌对草地贪夜蛾的研究较少。本研究通过室内杀虫活性测定发现，短稳杆菌对草地贪夜蛾幼虫具有优良的毒杀效果；
田间药效试验结果显示，短稳杆菌处理7 d后对草地贪夜蛾幼虫的防效在90.00%以上，高于植物源药剂苦参碱，与化学药剂氯虫苯甲酰胺的防效相当。前人研究结果表明，短稳杆菌对茶尺蠖（姚惠明等，2017）、水稻二化螟（孙剑华等，2018）、玉米黏虫（王义生等，2018）和水稻稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis）（吴琳等，2019）等鳞翅目害虫均具有较好的防治效果，本研究结果与之相似。然而，100亿孢子/mL短稳杆菌悬浮剂是否会对玉米田中性昆虫及天敌的安全性、天敌的捕食和寄生能力造成影响有待进一步研究。
短稳杆菌通过害虫的取食进入消化道，并转移到体腔和血淋巴等处大量增殖，释放有毒物质，导致病虫死亡（李良德等，2020）。昆虫在受到外源有毒物质胁迫后，可通过增加体内解毒代谢酶GST、CarE及AChE活性对有毒物质进行分解和代谢；
当虫体内有毒物质量超过自身解毒代谢能力时，虫体机能下降，解毒酶活性下降，昆虫中毒死亡（Yang et al.，2013；
张鑫乾等，2014）。李良德等（2020）研究发现，短稳杆菌在处理茶尺蠖幼虫24 h后，茶尺蠖幼虫体内GST、CarE和AChE活性呈下降趋势。本研究中短稳杆菌处理草地贪夜蛾1、2和3龄幼虫48 h后，虫体内的GST、CarE和AChE活力整体表现出受抑制现象，与短稳杆菌处理茶尺蠖后的结果类似，推测短稳杆菌对害虫的GST、CarE和AChE活性的抑制作用与其杀虫效果相关。结合短稳杆菌对草地贪夜蛾的室内杀虫活性结果和田间防效，推测该药剂处理后解毒酶和AChE活性下降可能与虫体活性下降有关，具体的杀虫机理有待后续进一步探究。
本研究结果表明，短稳杆菌对草地贪夜蛾低龄幼虫的生物防治潜力较大，可用于替代当前市场上风险较高的化学农药，也可在玉米生产上与化学农药交替使用。玉米田草地贪夜蛾低龄幼虫多聚集在叶片上，3龄以后的幼虫分散且进入暴食阶段（吴孔明，2020），因此在田间防治时一定要“打早打小”，在草地贪夜蛾低龄幼虫盛发期使用100亿孢子/mL短稳杆菌悬浮剂进行防治，以减少因化学农药过量施用带来的害虫抗药性、天敌减少以及环境污染等问题。
短稳杆菌在室内和田间对草地贪夜蛾低龄幼虫均有较强的毒杀作用，可作为防治草地贪夜蛾有效的生物农药使用。在玉米田草地贪夜蛾低龄幼虫盛发期，使用100亿孢子/mL短稳杆菌悬浮剂进行防治时，建议使用800~1000倍液喷施。
猜你喜欢 甲酰胺化学农药生物农药 日本计划到2050年将化学农药使用量减半三农资讯半月报(2021年5期)2021-03-22化学农药协同增效实现使用量零增长 省植保站组员参加国家』化学农药协同增效关键技术今日农业(2019年11期)2019-08-1535%丙硫菌唑·吡唑醚菌酯·氯虫苯甲酰胺种子处理悬浮剂液相色谱分析方法农药科学与管理(2019年10期)2019-04-202025年全球生物农药市场规模将达到95亿美金世界农药(2019年4期)2019-01-06化学农药对农业环境的污染与防治农民致富之友(2018年11期)2018-06-28上海国际生物农药与微生物肥料发酵技术展览会今日农药(2016年7期)2016-05-142015中国植保市场生物农药畅销品牌产品今日农药(2016年6期)2016-05-14插层条件对蒙脱土/偶氮二甲酰胺复合发泡剂的影响及应用中国塑料(2016年11期)2016-04-16小麦粉中偶氮甲酰胺的太赫兹时域光谱检测中国粮油学报(2016年1期)2016-02-06生物农药新亮点中国农资(2015年4期)2015-01-31