陶士杰 宋艳冬 吴沁娇 周宇峰 杨 杰
（1浙江农林大学环境与资源学院，浙江杭州 311300；
2丽水市农林科学研究院，浙江丽水 323000；
3福建省林业科学研究院，福建福州 350012）
植物精油是植物体内的次生代谢产物，由分子量相对较小的化合物组成，可通过水蒸气蒸馏进行提取［1］。研究表明，植物精油成分复杂，由几十至上百种化合物组成，大都具有特殊香味，且具有一定的抗菌效果和抗氧化活性［2-4］。不同的植物精油具有不同的化学成分和生物活性，且同一种植物精油的化学成分和生物活性也往往会受植物自身年龄等内部因素和海拔等外部环境的影响［5-7］。
竹子是一种重要的森林资源，挖掘其开发利用价值是当前竹产业转型升级的前提和基础。第九次森林资源清查结果显示，中国竹资源丰富，竹林面积为641.16万公顷，约占世界竹林总面积的20%［8］。黄甜竹（Acidosasa edulis）属禾本科竹亚科酸竹属，是一种优质的笋用竹种［9］。但黄甜竹叶的开发利用较少，造成了资源的较大浪费。关于竹叶精油，已有学者对部分竹种开展了相关研究，姚曦等［10］研究表明梁山慈竹竹叶精油对水稻自叶枯菌有很强的抑制能力。郭静等［11］对淡竹叶和苦竹叶抗氧化活性做了分析，发现芹菜素和异荭草苷分别是淡竹叶和苦竹叶抗氧化活性的主要成分。Chuyen等［12］用二乙醚和乙酸乙酯溶剂对山白竹叶进行精油提取，发现山白竹叶精油具有很强的抑菌效果。而关于黄甜竹叶精油的化学成分鉴定以及抑菌效果和抗氧化活性的相关研究尚鲜见报道。为进一步了解黄甜竹叶精油的化学成分和生物活性，并探究海拔高度和竹子年龄对黄甜竹叶精油的化学成分和抑菌效果以及抗氧化活性的影响，本研究提取不同海拔的当年生新竹叶片（简称新叶）和非当年生竹叶片（简称老叶）精油后对其化学成分进行鉴定，并比较抑菌效果和抗氧化活性，以期为黄甜竹叶的进一步开发利用提供科学依据。
1.1 样地设置与样品采集
试验样地设有3个海拔高度，分别为：高海拔（平均海拔800 m，浙江省丽水市缙云县新建镇鱼川村）、中海拔（平均海拔560 m，浙江省丽水市云和县雾溪畲族乡砻头村）和低海拔（平均海拔85 m，浙江省丽水市莲都区白云街道城西村）。样地均为2016年造林形成的竹林，坡度为15°～20°。每个样地的种植土均为黄壤土，土层厚度为30～50 cm。土壤都经过适当的改良处理，以保持样地的土质一致，且每个样地的黄甜竹栽培管理技术也保持一致。每个海拔高度分别设置3个20 m×30 m的样地作为重复。将各样地内的竹株分为两个年龄段，分别为新竹（当年生竹）和老竹（非当年生竹），每个年龄段各选择5株作为样株。分别采集新竹样株的叶片（简称新叶）和老竹样株的叶片（简称老叶）各1 kg，采样时间为2020年7月。
1.2 仪器与试剂
GX-05粉碎机，上海淀久中药机械制造有限公司；
ZNBC-CL程序控温电热套，巩义市科瑞仪器有限公司；
AB104-N电子分析天平，梅特勒托利多仪器上海有限公司；
Trace GC/ISQ气相色谱—质谱联用仪，美国Thermo Fisher公司；
57330-U手动固相微萃取进样手柄、SAAB-57300U型聚二甲基硅氧烷萃取头（100µm），上海安谱科学仪器有限公司。
分析纯酒精，济南鑫顺化工有限公司。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）：取洗净去皮的马铃薯200 g，切成小块，加水1 000 mL煮沸0.5 h，2层纱布过滤，加入称量好的葡萄糖和琼脂，搅拌均匀并溶解后，定容至1 000 mL，分装于250 mL三角瓶中，121℃下0.1 MPa灭菌20 min，备用。葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）和干腐病菌（Fusarium）由丽水市农林科学研究院提供。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH），上海通蔚实业有限公司。
1.3 样品前处理
将新鲜竹叶在室内自然阴干（2～3 d）后，放入40℃烘箱中烘干5 h，用粉碎机打碎后过40目筛，然后储存于-40℃冰箱备用［13］。
1.4 竹叶精油提取与成分测定
参照文献［13］，通过水蒸气蒸馏法萃取竹叶精油。将50 g竹叶样品置于1 L蒸馏瓶内，加入400 mL水，用电热套加热至100℃，提取4 h。蒸馏液体用二氯甲烷萃取，然后置于通风橱中，使二氯甲烷挥发完全。
提取完成后，用气相色谱-质谱联用仪（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）对精油成分进行分析。HP-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，膜厚0.25 µm）；
程序升温：柱初温60℃，保持2 min，以30℃·min-1升温 至190℃，再 以10℃·min-1升 温至230℃，保持时间10 min；
分流比10∶1；
进样量1µL；
进样口温度180℃；
辅助加热器温度280℃，质谱EI离子源，电子能量70 eV，电子倍增器电压1 250 V，扫描范围30～500 m/z，谱库NIST08。
1.5 抑菌试验培养基制备及菌种培养
培养基制备采用PDA配制方法。
参照吴会杰等［14］的方法并稍作修改。取PDA培养基上28℃生长4～5 d（菌丝均匀布满培养基）的葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）和干腐病菌（Fusarium），在菌落边缘用直径5 mm的无菌打孔器打取菌饼，并用接种针将菌饼移入涂有精油溶液培养基的中央。每菌株抑菌试验重复3次，以不含精油溶液的空白PDA培养基为对照。28℃培养箱内培养24 h后，采用十字交叉法测量菌丝生长直径，取平均值。按照公式计算菌丝生长抑制率：
式中，I为菌丝生长抑制率，%；
D0为空白对照菌落生长直径；
Dt为精油处理菌落生长直径。
1.6 体外抗氧化活性测定
体外抗氧化活性测定采用DPPH法。将不同的竹叶精油样品用无水乙醇稀释，分别配置成浓度为5、2.5、1.25和0.625µL·mL-1的精油溶液。取不同浓度的精油溶液1 mL，加入1 mL配好的0.1 mmol·L-1DPPH乙醇溶液，摇匀后，放在暗处反应30 min，测定其在517 nm波长处的吸光度值；
对照组以等体积的无水乙醇代替精油溶液测定吸光度值。每组重复3次并取平均值，参照谌迪等［15］的方法计算半抑制浓度（halfinhibitory concentration，IC50）值。
1.7 数据处理
用SPSS statistics 22统计分析软件对所有试验数据进行单因素方差分析（ANOVA analysis）。
2.1 黄甜竹叶精油成分分析
按1.4中GC-MS条件对黄甜竹叶精油的化学成分进行分析，经鉴定，共确定50种主要化学成分，其中烷类15种、醇类15种、萜烯类6种、芳香族化合物7种、酯类3种、酮类2种、醛类1种、酸类1种。
黄甜竹叶精油化学成分及相对含量如表1及图1所示。从海拔高度来看，在高海拔叶片精油中，鉴定出34种成分，占总含量的94.23%，其中烷类占45.33%、醇类占12.34%、萜烯类占25.63%、芳香族占6.42%、酮类占3.35%、酯类占0.27%、醛类占0.30%、酸类占0.62%。其主要成分为1，7-二甲基-7-（4-甲基-3-戊烯基）-三环［2.2.1.0（2，6）］庚烷、（+）-喇叭烯、正己烷、氯代十八烷等。在中海拔叶片精油中，鉴定出37种成分，占总含量的95.42%，其中烷类占36.79%、醇类占11.62%、萜烯类占27.31%、芳香族占14.34%、酮类占2.91%、酯类占1.40%、醛类占1.06%。其主要成分为1，7-二甲基-7-（4-甲基-3-戊烯基）-三环［2.2.1.0（2，6）］庚烷、（+）-喇叭烯、2，3-二氢苯并呋喃、（1S-外）-2-甲基-3-亚甲基-2-（4-甲基-3-戊烯基）双环［2.2.1］庚烷等。在低海拔叶片精油中，鉴定出38种成分，占总含量的94.80%，其中烷类占42.11%、醇类占23.24%、萜烯类占11.78%、芳香族占15.55%、酮类占0.63%、酯类占0.94%、醛类占0.55%。其主要成分为2，3-二氢苯并呋喃、3-己烯-1-醇、2，4-二甲基己烷、氯代十八烷等。
图1 不同海拔和竹龄精油中各类成分相对含量Fig.1 Relative content of various components of essential oil at different altitudes and bamboo ages
表1 (续)
表1 黄甜竹叶精油化学组分及相对含量Table 1 Chemical composition and relative content of Acidosasa edulis leaves essential oil /%
从竹龄上来看，在新叶精油中，鉴定出46种成分，占总含量的95.50%，其中烷类占35.46%、醇类占17.84%、萜烯类占23.77%、芳香族占14.10%、酮类占2.65%、酯类占0.60%、醛类占0.67%、酸类占0.41%。其主要成分为（+）-喇叭烯、2，3-二氢苯并呋喃、氯代十八烷、3-乙基-5-（2-乙基丁基）-十八烷等。在老叶精油中，鉴定出41种成分，占总含量的94.13%，其中烷类占47.36%、醇类占13.63%、萜烯类占19.38%、芳香族占10.10%、酮类占1.94%、酯类占1.13%、醛类占0.60%。其主要成分为1，7-二甲基-7-（4-甲基-3-戊烯基）-三环［2.2.1.0（2，6）］庚烷、（1S-外）-2-甲基-3-亚甲基-2-（4-甲基-3-戊烯基）双环［2.2.1］庚烷、（+）-喇叭烯、2，3-二氢苯并呋喃等。
综上，在竹叶精油中检测并鉴定出多种成分，主要分为烷类、萜烯类、醇类和芳香族化合物四类。不同海拔和竹龄竹叶精油的主要化学成分基本相同，差异主要体现在各成分的含量上。从海拔高度来看，中高海拔下的竹叶精油中萜烯类化合物相对含量较高；
从竹龄来看，新叶中的醇类、萜烯类和芳香族化合物相对含量较高。
2.2 黄甜竹叶精油的抑菌效果
由表2可知，从海拔高度来看，在高海拔、中海拔和低海拔下，黄甜竹叶精油对干腐病菌的抑制率分别为36.03%、34.82%和9.31%；
对葡萄座腔菌的抑制率分别为34.81%、28.45%和18.06%。高海拔的黄甜竹叶精油对干腐病菌的抑制率比低海拔的黄甜竹叶精油高26.72个百分点，中海拔的黄甜竹叶精油对干腐病菌的抑制率比低海拔的黄甜竹叶精油高25.51个百分点，可见中高海拔竹叶精油抑菌效果强于低海拔。从竹龄来看，黄甜竹新叶精油对干腐病菌和葡萄座腔菌的抑制率分别为47.15%和41.55%，黄甜竹老叶精油对干腐病菌和葡萄座腔菌的抑制率分别为6.29%和12.66%。新叶精油对干腐病菌和葡萄座腔菌的抑制率比老叶精油分别高40.86和28.89个百分点，可见黄甜竹新叶精油的抑菌效果强于老叶。
表2 不同海拔和竹龄精油的抑菌效果Table 2 Bacteriostatic effect of essential oil at different altitudes and bamboo ages /%
由图2可知，同一海拔高度下，黄甜竹新叶精油对干腐病菌和葡萄座腔菌的生长抑制作用均显著高于老叶精油。在3个不同海拔高度下，黄甜竹新叶精油对干腐病菌的生长抑制率表现为中海拔>高海拔>低海拔，且不同海拔间差异显著；
随着海拔高度的增加，黄甜竹老叶精油对干腐病菌和葡萄座腔菌两种菌种的生长抑制率均显著增加。
图2 黄甜竹叶精油对干腐病菌和葡萄座腔菌的抑制效果Fig.2 Inhibition of Fusarium and Botryosphaeria dothidea by Acidosasa edulis leaves essential oil
2.3 黄甜竹叶精油抗氧化活性
黄甜竹叶精油清除DPPH自由基的能力可以用半抑制浓度（IC50）来表示，IC50值越小，表明精油对DPPH自由基的清除能力越强，抗氧化活性越好。由表3可知，从海拔高度上看，高海拔和中海拔下黄甜竹叶精油的IC50值分别为2.889和0.473 µL·mL-1，而低海拔下黄甜竹叶精油的IC50值小于0.001µL·mL-1。可见，低海拔地区的黄甜竹叶精油抗氧化活性最强，中海拔地区次之，高海拔地区最弱。从竹龄上看，黄甜竹新叶精油和老叶精油的IC50值分别为0.115和1.715µL·mL-1。可见，黄甜竹新叶精油的抗氧化活性强于老叶。
表3 不同海拔和竹龄竹叶精油的半抑制浓度值Table 3 The half-inhibitory concentration of Acidosqsq edulis leaves essential oil at different altitudes and bamboo ages
由图3可知，在精油溶液浓度为2.5µL·mL-1及以下时，相同精油溶液浓度不同海拔黄甜竹新老叶精油之间的DPPH自由基清除率整体差异显著，当精油溶液浓度为0.625µL·mL-1时，低海拔新叶的DPPH自由基清除率最高，高海拔老叶的DPPH自由基清除率最低，除高海拔新叶和中海拔老叶外，其余各叶片精油对DPPH自由基的清除率均存在显著差异。总的来看，精油溶液浓度越大，各海拔黄甜竹新老叶精油对DPPH自由基的清除率越高，抗氧化活性越强。
图3 不同浓度下黄甜竹叶精油的抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of Acidosasa edulis leaves at different concentrations
本研究采用GC-MS技术，以高、中、低海拔地区的黄甜竹新老叶为原料进行黄甜竹精油提取，并用二氯甲烷萃取后进行成分分析，共鉴定出50种主要成分，以烷类、萜烯类、醇类和芳香族化合物等为主，且烷类物质占比较大，这与何跃君［16］和吕兆林等［17］的研究结果相似，但具体种类和含量存在一定的差异，主要原因可能与竹种不同有关。同时，本研究在中高海拔的竹叶精油中检测出更多含量的萜烯类物质，这与Martz等［18］和Said等［19］的结论一致。可能是由于外界环境对植物内部生理因素产生了作用，如海拔的变化会导致温度、相对湿度、可用水量和辐射率产生相应变化；
中高海拔地区的温度更高，湿度更低，使植物中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的含量增加，从而抑制光合作用；
为了保护细胞和光合器官，植物体内会生成更多萜烯类物质来减少脂质过氧化、抑制NO释放和ROS生成［19-20］。
许多植物具有广谱的抑菌性，而真正具有抑菌效果的是植物精油［21］。与化学抑菌剂相比，植物精油在食品中的副作用小、残留毒性小，是开发新型高效低毒天然香料、防腐杀菌剂的重要来源［21］。本研究发现，竹叶精油中的萜烯类、醇类和酮类是发挥抑菌效果的主要化合物，且相同化合物对不同菌株表现出不同的抑制功效，这与前人研究结果相吻合［22-24］。另外，化合物的抑菌效果可能与其所含不饱和键的种类和数量有关，富含不饱和双键的醇、醛、酮、酸类和萜烯类化合物可能对抑菌效果起着重要作用［22］。这些因素可能是黄甜竹叶精油起到抑菌效果的主要原因。本研究还发现，中高海拔黄甜竹新叶精油中的萜烯类和酮类化合物含量相比于低海拔黄甜竹老叶含量更多，体现出更强的生物活性和抑菌效果，刘林芳［6］的研究也得出了类似的结论。另外，姚永红等［23］和杨萍等［24］研究指出竹叶精油中某些单一组分发挥着抑菌效果，而将这些单一组分混合之后，抑菌效果会得到提升。由此推测精油的抑菌效果是其所有抑菌组分及其他单独抑菌效果不明显的微量元素协同作用的结果，但具体的抑菌作用机制还需进一步深入探讨。
植物精油的抗氧化活性可能在一些疾病的预防中发挥重要作用，如脑功能障碍、癌症、心脏病和免疫系统衰退等［25］。本研究发现，黄甜竹叶精油体现出较强的抗氧化活性是因为竹叶精油的组成为醇类、酚类和酮类等具有各种官能团的化合物。梁荣等［26］研究指出酚类化合物的邻位酚羟基极易被氧化成醌类结构，并能捕捉环境中的自由基，因此酚类化合物具有很强的抗氧化活性。何跃君等［27］研究也指出竹叶精油中含有许多不饱和的醇、醛、酮、酸和萜烯类化合物，这些化合物具有抗氧化活性。本研究分析黄甜竹叶精油的物质组成，推测凡是可以与自由基进行反应，使自由基形成稳定状态的成分都有可能起到清除DPPH自由基的作用，这与Priyadarsini等［28］的研究结论一致。另外，本研究结果显示，低海拔地区黄甜竹叶精油的抗氧化活性强于中高海拔两地，可能是由于低海拔地区黄甜竹叶精油中的醇类和芳香族化合物含量较高，具有更多的酚基及环结构，这些结构是抗氧化活性的重要基础，这也与何跃君［16］的研究结论相吻合。而具体是哪种或哪些组分起到黄甜竹叶精油抗氧化活性的决定性作用，还需进一步深入研究。
本研究分析鉴定了高、中、低三处不同海拔黄甜竹新老叶精油的化学成分，并比较了其抑菌效果和抗氧化活性。结果表明，在黄甜竹叶精油中检测到烷类、萜烯类、醇类和芳香族化合物等多种化合物；
黄甜竹叶精油具有较强的抑菌效果和抗氧化活性，且中高海拔黄甜竹叶精油的抑菌效果高于低海拔黄甜竹叶精油，新叶精油的抑菌效果和抗氧化活性高于老叶精油。因此，在黄甜竹叶精油的开发利用中，应优先考虑中高海拔的新叶。