林春淑 舒晓春 肖菲娜 彭虹 容婵 江健 胡洁华 孟晓军
随着社会的快速发展，人们生活方式、饮食结构的改变和社会人口的老龄化，糖尿病的发病率在全球范围内呈现逐年上升趋势，成为影响人们健康的慢性疾病之一。研究表明，高糖对MC3T3-E1成骨细胞增殖有抑制作用[1]，诱导成骨细胞凋亡[2]，长期高血糖可使糖尿病患者骨细胞分化受影响，破坏骨代谢的动态平衡，导致骨形成减少。成骨细胞的活力降低是导致糖尿病性骨病的主要原因[3]。糖尿病性骨质疏松患者容易发生骨折，已成为糖尿病患者生活质量下降的主要原因之一。目前骨质疏松的主要治疗药物有骨吸收抑制剂和骨形成促进剂两类，如雌激素、二磷酸盐等，但这些药物治疗的同时出现了一定的副作用。当前以信号通路等研究为依据的各种骨生长因子制剂逐渐被开发，疗效也较好，促进骨形成类药物是未来骨质疏松症治疗药物的发展趋势之一[4]。Akt 信号通路广泛存在于动物细胞中，参与多种细胞增殖、分化和凋亡调节[5]。柚皮苷（naringin，NG）是一种双氢黄酮类化合物，主要来源于芸香科植物的果皮和果肉中，在降血脂、调节血糖等方面具有较强的生物活性[6]。唐琪等[7]研究表明NG 对成骨细胞增殖有一定的促进作用。还有研究发现NG 可提高大鼠的骨密度和促进骨形成的作用[8]。本研究观察不同浓度NG 作用于高糖环境下的MC3T3-E1细胞活力的变化，并检测成骨细胞相关分化因子的表达情况，为进一步应用NG 治疗糖尿病性骨质疏松提供实验依据。
一、材料
小鼠前成骨细胞株MC3T3-E1（南方医科大学生命科学院）；
Naringin（美国TARGET Mol公司，cas：10326-47-2）；
α-MEM培养基（广州凯基生物公司，葡萄糖浓度为5.6 mmol/L）；
胎牛血清（杭州四季青公司）；
CCK-8 试剂盒（沈阳万类生物公司）、D-（+）-葡萄糖（美国Sigma公司）、胰蛋白酶溶液-EDTA 溶液（广州凯基生物公司）、SYBR®Premix Ex Taq™（TliRNaseH Plus）[宝日医生物技术（北京）有限公司]、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）[宝日医生物技术（北京）有限公司]、蛋白提取试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），BCA 蛋白定量检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。
二、方法
1.MC3T3-E1细胞的培养：MC3T3-E1细胞复苏后，加入含10%胎牛血清的完全培养基，置于5 %CO2、37℃恒温培养箱中培养。待细胞融合度达到90 %时，用0.25 %胰蛋白酶进行消化，再以300×g离心5 min 收集细胞，传代培养。
2.实验分组及处理：分为对照组（正常无血清培养基）、高糖组（含25 mmol/L 葡萄糖）、0.1 μmol/L+高糖组（0.1 μmol/L NG+25 mmol/L葡萄糖）、1 μmol/L+高糖组（1 μmol/L NG+25 mmol/L 葡萄糖）、10 μmol/L+高糖组（10 μmol/L NG+25 mmol/L葡萄糖）。以二甲基亚砜为溶剂配制浓度为10 mmol/L 的柚皮苷储备液，后分别用培养基稀释成10、1、0.1 μmol/L 3个药物浓度组，不加药物组在培养基中加入0.1 %的DMSO 溶剂。
3.CCK-8 法检测细胞活力：取生长良好的MC3T3-E1细胞，以1×104个/孔的密度接种于96 孔板，恒温培养箱中预培养24 h。待细胞贴壁后，加入各实验组的培养基干预12、24、48 h，向每孔加入100 μL CCK-8 溶液，温箱孵育1 h，用酶标仪测定各孔在450 nm 处的吸光度值。
4.实时荧光定量PCR（qPCR）法检测NG对高糖作用下MC3T3-E1细胞胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）、蛋白激酶（Akt1）、细胞成骨特异性转录因子（Runx2）的mRNA表达：将细胞1×105个/mL，以每孔2 mL细胞悬液接种于6 孔板，恒温箱预培养24 h后，加入各实验组无血清培养基分别干预24、48 h，提取各实验组细胞总RNA，逆转录获得cDNA，Real-time PCR分析采用SYBR®Premix Ex Taq™PCR试剂盒。引物序列如表1所示。反应条件：95℃ 30 s，95℃ 3 s，60℃ 34 s（收集荧光信号），共40个循环。GAPDH 作为内参照，数据使用2-ΔΔCt方法进行分析。
表1 引物序列信息
5.Western blot 法检测NG 对高糖作用下MC3T3-E1细胞IGF-1、Akt1 及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）蛋白表达的影响：取生长良好的细胞，以1×106个/ml 密度接种于25 cm2透气培养瓶中，待细胞贴壁后加入各实验组含药培养基，干预24、48 h。用TBS 缓冲液冲洗细胞2～3次，加入200 μL 的细胞蛋白裂解液，冰浴30 min，确保细胞完全裂解，12 000×g离心15 min，收集上清液。用BCA 蛋白试剂盒测定蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液在100℃加热10 min 进行蛋白变性，200 mA 转膜60 min。将转好的膜于室温下脱色摇床上用5 %的脱脂牛奶（0.5 %TBST 缓冲液配），封闭1 h，稀释一抗（TBST 溶解的5 %脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST 溶解的5 %牛血清白蛋白BSA），4℃过夜。用TBST 在室温下脱色摇床上洗3次，每次5 min，将二抗用TBST 稀释3 000倍，室温下孵育30 min后，用TBST 在室温下脱色摇床上洗3次，每次5 min。用电化学发光（ECL）进行发光显影，通过蛋白条带灰度分析进行定量测定。各组MC3T3-E1细胞IGF- 1、Akt1、ALP 蛋白的表达，是在同一凝胶上上样检测。Akt（60 kDa）、IGF-1（22 kDa）和内参（beta-actin 42 kDa）分子量相差较大，通过剪膜的方式分开孵育的；
ALP（39 kDa）和内参分子量接近，通过膜再生的方式重新孵育不同的抗体。
三、统计学分析方法
采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，相关基因与蛋白的相对表达量用表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。
一、NG 在高糖环境下增加了MC3T3-E1细胞的活力
CCK8 检测结果显示，与对照组比较，高糖组细胞OD 值均降低，差异有统计学意义（P＜ 0.01）；
与高糖组比较，0.1 μmol/L+高糖组细胞OD 值在24、48 h 升高，1 μmol/L+高糖组和10 μmol/L+高糖组OD 值在12、24、48 h 均升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。（表2）
二、NG 在高糖环境下上调了MC3T3-E1细胞Runx2、IGF-1、Akt1 的mRNA表达
与对照组比较，24 h 高糖组细胞Runx2、IGF-1、Akt1 的mRNA 的表达水平 降低，差异有统计学意义（P＜ 0.01）；
48 h 高糖组细胞Runx2、Akt1 的mRNA的表达水平降低，差异有统计学意义（P＜ 0.01）。与高糖组比较，1 μmol/L+高糖组和10 μmol/L+高糖组细胞Runx2、IGF-1、Akt1 mRNA表达水平在24、48 h 均升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。与高糖组比较，0.1 μmol/L+高糖组在24 h 时Akt1 mRNA 的表达水平和48 h 时IGF- 1 mRNA 的表达水平差异无统计学意义（P＞ 0.05）。（表3～4）
表2 NG 对高糖环境下MC3T3-E1 的CCK-8 检测结果（± s）
表2 NG 对高糖环境下MC3T3-E1 的CCK-8 检测结果（± s）
注：与对照组比较，aP ＜ 0.05；
与高糖组比较，bP ＜ 0.05；
与0.1 μmol/L+高糖组比较，cP ＜ 0.05；
与1 μmol/L+高糖组比较，dP ＜ 0.05
分组 实验次数 12 h 24 h 48 h对照组 3 0.90±0.01 1.00±0.05 1.09±0.03高糖组 3 0.80±0.01a 0.84±0.01a 0.90±0.01a 0.1 μmol/L+高糖组 3 0.82±0.01a 0.93±0.05b 0.99±0.01 ab 1 μmol/L+高糖组 3 0.92±0.01bc 1.01±0.04bc 1.12±0.02bc 10 μmol/L+高糖组 3 1.01±0.32 abcd 1.16±0.03 abcd 1.20±0.02 abcd F 值 74.876 49.449 143.567 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001
表3 干预24 h后不同浓度NG 对高糖环境下MC3T3-E1细胞Runx2、IGF-1、Akt1 mRNA表达的影响（± s）
表3 干预24 h后不同浓度NG 对高糖环境下MC3T3-E1细胞Runx2、IGF-1、Akt1 mRNA表达的影响（± s）
注：与对照组比较，aP ＜ 0.05；
与高糖组比较，bP ＜ 0.05；
与0.1 μmol/L+高糖组比较，cP ＜ 0.05；
与1 μmol/L+高糖组比较，dP ＜ 0.05
分组 实验次数 Runx2 IGF-1 Akt1对照组 3 1.00 1.00 1.00高糖组 3 0.34±0.02a 0.34±0.01a 0.15±0.02a 0.1 μmol/L+高糖组 3 0.50±0.15 ab 0.61±0.14 ab 0.21±0.02a 1 μmol/L+高糖组 3 0.62±0.09 ab 0.77±0.03 ab 0.24±0.08ab 10 μmol/L+高糖组 3 0.64±0.05 abc 1.02±0.07bcd 0.40±0.09abc F 值 24.016 47.571 48.036 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001
表4 干预48 h后不同浓度NG 对高糖环境下MC3T3-E1细胞Runx2、IGF-1、Akt1 mRNA表达的影响（± s）
表4 干预48 h后不同浓度NG 对高糖环境下MC3T3-E1细胞Runx2、IGF-1、Akt1 mRNA表达的影响（± s）
注：与对照组比较，aP ＜ 0.05；
与高糖组比较，bP ＜ 0.05；
与0.1 μmol/L+高糖组比较，cP ＜ 0.05；
与1 μmol/L+高糖组比较，dP ＜ 0.05
分组 实验次数 Runx2 IGF-1 Akt1对照组 3 1.00 1.00 1.00高糖组 3 0.72±0.03a 1.09±0.07a 0.38±0.04a 0.1 μmol/L+高糖组 3 0.76±0.03ab 1.14±0.20 0.63±0.36ab 1 μmol/L+高糖组 3 1.27±0.02abc 2.44±0.19abc 0.86±0.06abc 10 μmol/L+高糖组 3 1.37±0.02abcd 2.73±0.04 abc 1.43±0.03abcd F 值 559.110 126.311 318.142 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001
三、NG 在高糖环境下上调了MC3T3-E1细胞ALP、Akt1、IGF-1 蛋白的表达
与对照组比较，高糖组MC3T3-E1细胞IGF-1、ALP、Akt1蛋白表达水平在48 h均降低，差异有统计学意义（P＜ 0.01）。与高糖组比较，0.1 μmol/L+高糖组、1 μmol/L+高糖组和10 μmol/L+高糖组ALP、Akt1、IGF-1 蛋白表达水平在48 h 均升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05，表5～6，图1）。
图1 免疫印迹检测不同时间点各组MC3T3-E1细胞IGF-1、Akt1、ALP 蛋白的表达
表5 干预24 h后不同浓度NG 对高糖环境下MC3T3-E1细胞ALP、Akt1、IGF-1 蛋白表达的影响（± s）
表5 干预24 h后不同浓度NG 对高糖环境下MC3T3-E1细胞ALP、Akt1、IGF-1 蛋白表达的影响（± s）
注：与对照组比较，aP ＜ 0.05；
与高糖组比较，bP＜0.05；
与0.1 μmol/L+高糖组比较cP ＜ 0.05；
与1 μmol/L+高糖组比较dP ＜ 0.05
分组 实验次数 ALP Akt 1 IGF-1对照组 3 1.00 1.00 1.00高糖组 3 0.53±0.03a 1.03±0.02 0.23±0.03a 0.1 μmol/L+高糖组 3 1.07±0.06b 1.03±0.08 0.24±0.04a 1 μmol/L+高糖组 3 1.92±0.02 abc 1.26±0.03abc 2.14±0.15abc 10 μmol/L+高糖组 3 2.36±0.38abc 1.05±0.05d 2.44±0.39abc F 值 57.217 18.252 91.925 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001
表6 干预48 h后不同浓度NG 对高糖环境下MC3T3-E1细胞ALP、Akt1、IGF-1 蛋白表达的影响（± s）
表6 干预48 h后不同浓度NG 对高糖环境下MC3T3-E1细胞ALP、Akt1、IGF-1 蛋白表达的影响（± s）
注：与对照组比较，aP ＜ 0.05；
与高糖组比较，bP ＜ 0.05；
与0.1 μmol/L+高糖组比较cP ＜ 0.05；
与1 μmol/L+高糖组比较dP ＜ 0.05
分组 实验次数 ALP Akt 1 IGF-1对照组 3 1.00 1.00 1.00高糖组 3 0.72±0.02a 0.89±0.03a 0.09±0.01a 0.1 μmol/L+高糖组 3 1.92±0.02 ab 1.50±0.03ab 1.75±0.01ab 1 μmol/L+高糖组 3 2.30±0.30abc 1.43±0.04ab 2.30±0.31abc 10 μmol/L+高糖组 3 3.09±0.10abcd 1.40±0.13ab 2.07±0.07ab F 值 144.575 61.914 124.093 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001
骨质疏松症是常见的代谢性骨病，研究发现高糖明显降低成骨细胞增殖和矿化结节明显减少[9]，引发骨保护素减少、矿物质量的降低[10]。糖尿病性骨质疏松是糖尿病在骨骼系统的重要并发症之一，患者骨组织微结构改变，成骨细胞数量减少，骨强度降低、脆性增加，骨折发生风险明显增加[11]。
NG 具有促进骨髓间充质干细胞骨向分化的能力[12]，可以促进成骨细胞增殖、分化[13]。容婵等[14]研究表明NG 可以抑制地塞米松诱导的小鼠MC3T3-E1细胞凋亡。在钛颗粒诱导的糖尿病小鼠颅骨骨溶解实验中发现NG 有促进骨形成的作用[15]。MC3T3-E1细胞具有体外培养成骨细胞的多种生物学特性，是研究药物对成骨细胞影响的有价值的体外细胞模型。丁佩惠等[16]研究发现高浓度NG（10、1、0.1 μmol/L）在干预12 h 和24 h后促进MC3T3-E1细胞增殖，且几乎不影响细胞生长。本研究中，以MC3T3-E1细胞为研究对象，将不同浓度NG 溶液（10、1、0.1 μmol/L）+25 mmol/L 葡萄糖混合培养液，分别干预12、24、48 h后，观察到各个时间点高糖组均显著抑制MC3T3-E1细胞增殖，加入不同浓度NG 干预后，发现NG 在高糖环境下可促进MC3T3-E1细胞增殖，并呈一定的浓度依赖性，以10 μmol/LNG 组效果最显著。
IGF-1 可增加成骨细胞数目和活性以促进骨形成[17]，是骨生成的刺激因子，青春期可增加成骨细胞数量，成年期可维持骨量[18]。孙凯等[19]选取220例糖尿病患者，分为合并骨质疏松的观察组和无骨质疏松的对照组，对比发现观察组的IGF-1 水平明显低于对照组。邓子阳等[20]研究发现IGF-1 可增加糖尿病大鼠胫骨钙磷含量，其机制可能与IGF-1 促进骨骼重组人骨形态发生蛋白-2表达，提高骨碱性磷酸酶含量有关。因而，提高成骨细胞数量及IGF-1水平是预防和治疗糖尿病性骨质疏松的一个重要方向。
Akt 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在调控细胞存活和凋亡中起重要作用，Akt 激酶家族包括Akt1、Akt2 和Akt3 3个成员，与磷脂酰肌醇3 激酶（P13K）共同组成P13K/Akt 信号通路。PI3K/Akt信号通路是IGF-1 发挥作用的关键环节。江健[21]等研究发现盐酸小檗碱可以促进小鼠前成骨细胞的分化与矿化，其机制可能与其激活 PI3K/Akt 信号通路有关。丹参素通过活化 PI3K/Akt通路减少骨质疏松大鼠成骨细胞的凋亡[22]。张立超等[23]通过实验发现杜仲叶提取物可通过Akt通路促进大鼠成骨细胞增殖。Ulici 等[24]研究表明敲除Akt1 的小鼠骨骼变短，次级骨化中心的形成也相应延迟。有实验表明把能持久表达Akt1 的基因导入MC3T3-E1细胞中，Runx2表达增强，而使表达Akt1 的基因沉默后，Runx2表达也随之下降。Runx2 是骨形成最早的标志基因，是成骨细胞开始分化的标志，能够激活骨钙蛋白、骨桥素、骨涎蛋白和CO1I基因的转录和表达[25]，还可促进成骨细胞成熟和骨吸收[26]。Inada等[27]研究发现，Runx2基因敲除的小鼠表现出软骨细胞ALP 活性水平低，软骨内骨化被抑制。ALP 是骨形成的代谢指标，是成骨细胞早期分化的标记物，是骨折愈合和骨重建的重要生物标志[28]。元建民等[29]的研究发现高糖显著抑制了细胞的ALP 活性和分泌。朱聪等[30]的研究发现在成骨诱导14 d后，应力刺激组种子细胞的ALP 和Ca 结节染色阳性率增强。李念虎等[31]用NG 对体外培养的骨髓基质细胞进行干预后，发现NG 能明显提高细胞碱性磷酸酶ALP、骨钙素的表达，并应用NG 对卵巢摘除诱发骨质疏松的大鼠灌胃2个月后，发现其骨质疏松得到有效逆转。徐展望等[32]研究也发现NG 增强骨质疏松模型大鼠的骨强度，增大骨小梁面积，促进体外培养的骨髓间充质干细胞中Runx-2 的表达。
Runx2 是成骨细胞的转录因子，对骨组织的形成和重建起到重要作用。然而，Runx2 能促进成骨细胞早期分化，但对骨细胞的成熟有一定的抑制作用，因此，其蛋白水平的表达在本研究中无法给我们最明确的信息；
此外，Runx2 的功能多样，不仅仅影响成骨，对破骨，软骨也有影响，机制复杂，但其基因水平的表达情况为我们实验有很好的提示作用。而ALP 是成骨细胞分化的直接指标，能直接反应前成骨细胞的分化状态与活力。Akt1 是P13K/Akt通路的重要组成部分，张健博等[33]研究也发现通过靶向下调Akt1 抑制OA 软骨细胞的增殖，促进细胞凋亡。综合考虑，本研究主要检测MC3T3-E1细胞Akt1、Runx2 和IGF-1 mRNA 和IGF-1、Akt1、ALP 蛋白的表达水平。研究发现，24 h 和48 h 高糖组显著下调MC3T3-EI细胞Akt1、Runx2 的mRNA 的表达，24 h 下调了IGF-1 的mRNA 的表达，而不同浓度NG 组在干预24、48 h后，明显上调了MC3T3-E1细胞IGF-1、Akt1、Runx2 mRNA 的表达水平，并呈浓度依赖性，以10 μmol/LNG 组效果最明显。Western blot 法检测发现，高糖组显著下调MC3T3-E1细胞IGF-1、ALP、Akt1 蛋白的表达水平；
而不同浓度NG 组明显上调ALP、IGF-1、Akt1 蛋白的表达水平，同样呈浓度依赖性。通过实验说明高糖抑制了MC3T3-E1细胞IGF-1、Akt1、Runx2 mRNA 和IGF-1、Akt1、ALP 蛋白的表达水平，而NG 在高糖环境下则明显改善高糖的抑制作用，促进MC3T3-E1细胞IGF-1、Akt1、Runx2 mRNA 和IGF- 1、Akt1、ALP 蛋白的表达。
综上所述，NG 在高糖环境下具有促进前成骨细胞生长的潜能，其机制可能通过刺激IGF-1表达，激活Akt 信号通路及其下游因子Runx2，提高ALP 的表达，从而促进MC3T3-E1细胞的生长，促进骨形成，为临床应用NG 治疗糖尿病性骨质疏松提供了一定的实验依据。
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