伍红英 方慧祺 何水珍 曾凡伟 邓燕 林峰华 林海帆 陈轶群 李琳琳
人类中的恶性肿瘤较多,对人类的危害性较大,而结直肠癌就是其中的一种,其进展期致死性强,严重危害人类健康,但早期结直肠癌,尤其是黏膜层内结直肠癌行内镜黏膜下剥离术(ESD)或外科手术均可治愈,患者在诊断初期的5 年内生存率较高,高达90%［1］,但是临床上明确诊断结直肠癌时,多是该疾病的中晚期阶段,该类患者占比高达60%［2］。目前结直肠癌诊断的金标准是纤维结肠镜结合病理检查,其作为对身体的侵入性检查方式,为了提高检查效果,在患者检查前必须要饮用大量的水,同时还要服用清肠药物,较为痛苦,且检查时要求全结直肠充分清洁。受结直肠解剖结构特点、清洁程度、医务人员对病变的识别能力、退镜时间等因素影响,结直肠腺瘤的漏诊率可高达20%以上。大便潜血试验、粪钙卫蛋白、肿瘤标记物、影像学检查是目前临床推荐的筛查结直肠癌主要的检查手段,以上均为非侵入手段,安全性以及对于患者的舒适度较高,但是也存在一定的缺陷,其检测敏感性、特异性较差,诸多研究报道过这些检测方式不利于早期筛查结直肠癌,其检出率只有30%,因此临床上多不采用这些方式来早期诊断结直肠癌［3,4］。越来越多的研究发现,结直肠癌从发现到诊断,之后的持续发展与患者体内的DNA 甲基化状态相关［5-8］。因此,临床上多次提出将患者体内DNA 甲基化异常状态认定为早期结直肠癌的诊断指标。正常人体的肠道代谢每天有达到 5×1010级别的上皮细胞脱落,且肿瘤组织细胞更新速度快,粘附力低,故脱落速度更快,量更多,这也可以解释结直肠癌患者的粪便中大量存在肿瘤因素,包含上皮细胞上脱落而来的癌细胞和游离存在的癌DNA［9,10］。临床认为,肠道环境是碱性的,有利于癌DNA 的保存,这也导致研究从粪便中提取DNA 的保存更好,质量更高,为本研究提出的猜想提供了更好地支持。因此,粪便是检测DNA 甲基化状态的最佳标本。本文提出了要充分利用好MSP 技术,从而对结直肠癌患者粪便中的SDC2 和SEPT9 基因甲基化状态进行检查,以便于探讨其对结直肠癌筛查、早期诊断的价值。现报告如下。
1.1 一般资料 随机选取2020 年5 月～2021 年4 月厦门市海沧医院消化内科门诊及住院的25 例结直肠癌患者作为结直肠癌组,20 例结直肠腺瘤患者作为结直肠腺瘤组,15 例结直肠正常者作为正常对照组。60 例研究对象中男32 例,女28 例；
中位年龄45 岁。本研究中所选研究对象及其亲属均对本研究的具体事项和内容完全知晓,并且同意参与研究,签署了知情同意书。
1.2 纳入标准 ①年龄25～75 岁；
②结直肠癌组患者仅患有结直肠癌,除此之外不患有其他肿瘤疾病；
③三组所选取研究对象的性别比例均衡,组间年龄无统计学差异；
④所有粪便均在行结肠镜检查前收集,且收集前未服泻药；
⑤依据Bristol 粪便分类法,收集粪便要求第1 型～第5 型,量＞100 g；
⑥收集粪便前5 d 未行结肠镜、灌肠、消化道钡餐等操作；
⑦患者未行放化疗；
⑧正常对照组无严重疾病、遗传性非息肉病性大肠癌(HNPCC)家族史、家族性结肠息肉病。
1.3 方法 为保证本研究所提取样本的真实性,由厦门博创盛世生物技术有限公司、厦门艾德生物医药技术股份有限公司协助本课题组完成。
1.3.1 粪便DNA 的提取 收集研究对象结肠镜检查前粪便,放于检验科-80℃冰箱,提取粪便,约0.2 g,然后对粪便使用Solarbio 公司所提供的粪便基因组DNA 提取试剂盒进行DNA 的提取,提取出总DNA之后,再使用实验室的分光光度计对DNA 进行测量,选择A260、A280 进行纯度检测,对于检测合格的DNA 样品放于-20℃冰箱保存,而对于初次纯度检测不合格或较次的DNA 再次进行提取。
1.3.2 重亚硫酸盐修饰、纯化DNA 对提取到的DNA 使用QIAGEN 公司重亚硫酸盐DNA 甲基化试剂盒进行DNA 的修饰、纯化,获得患者粪便的重亚硫酸盐修饰和纯化的DNA,将其置于-20℃冰箱内保存。
1.3.3 MSP 技术分析SDC2 基因、SEPT9 基因甲基化状态 1 μl 引物F 和R,2 μl DNA 模板,4 μl dNTP,1 μl Ex Taq,5 μl 10×Ex Taq E buffer,用ddH2O 补至50 μl；
在95℃进行预变性,持续5 min；
在95℃进行变性,持续30 s；
在60℃进行退火,持续30 s；
在72℃进行延伸,持续30 s；
循环往复35 次后,在72℃进行再延伸,持续10 min；
在4℃条件下保存备用。接着对所提取到的产物进行检测,首先制作1%的琼脂糖凝胶,然后用其进行SDC2 基因、SEPT9 基因的聚合酶链式反应(PCR)产物检测。见表1。
表1 SDC2 基因、SEPT9 基因引物
1.4 观察指标 观察SDC2、SEPT9 基因甲基化检测结果,比较三组粪便中SDC2、SEPT9 基因甲基化检出率。
1.5 统计学方法 采用SPSS20.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。
2.1 SDC2 基因甲基化检测结果 结直肠癌组粪便中SDC2 基因甲基化检出率为76.00%,高于正常对照组的13.33%,差异具有统计学意义(P＜0.05)；
结直肠腺瘤组粪便中SDC2 基因甲基化检出率为80.00%,高于正常对照组的13.33%,差异具有统计学意义(P＜0.05)；
结直肠癌组与结直肠腺瘤组粪便中SDC2 基因甲基化检出率比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2,图1,图2,图3。
图1 结直肠癌组粪便SDC2 基因甲基化状态
图2 结直肠腺瘤组粪便SDC2 基因甲基化状态
图3 正常对照组粪便SDC2 基因甲基化状态
表2 三组粪便中SDC2 基因、SEPT9 基因甲基化检测结果比较［n(%)］
2.2 SEPT9 基因甲基化检测结果 结直肠癌组、结直肠腺瘤组、正常对照组粪便中SEPT9 基因甲基化检出率分别为16.00%(4/25)、5.00%(1/20)、0(0/15),比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表2,图4。
图4 结直肠癌组粪便SEPT9 基因甲基化状态
目前已经明确结直肠成癌途径有5 种,其中70%～80%由癌前病变(腺瘤)进展成为癌需要5～10 年,因此结直肠癌早期及癌前病变阶段的筛查及诊断意义重大。其中,CpG 岛是存在于真核生物,对其各个基因进行编码的主要调控区域,通常是非甲基化状态,其大小区间在100～1000 bp。患者出现结直肠癌的病因复杂多样,多种因素会对其造成影响,各种因素在其中协调互作。研究发现 CpG 岛是结直肠癌基因中的一种,启动子区域的CpG 岛发生甲基化后会出现抑癌基因的失活,而抑癌基因的失活导致患者患肿瘤的风险增加。研究发现,在患者出现癌前病变时,癌相关基因的启动子会随之出现甲基化；
并且在启动子的甲基化程度逐渐发展,以及细胞发生甲基化改变的情况逐渐增多时,都会使患者逐渐演变成结直肠癌。因此CpG 岛甲基化有望成为结直肠癌早期筛查及诊断的分子标记物［9-11］。
作为一种细胞表面的跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,SDC2 有两种途径出现癌变,其一是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径,其二是由上皮-间质转化而成［12,13］。有报道称,结直肠肿瘤患者粪便内的SDC2 基因甲基化发生频率和甲基化率明显高于正常人粪便或者非肿瘤邻近组织内的水平［14］。正如Niu 等［15］所报道的,结直肠癌患者组织中的SDC2 甲基化水平远高于邻近的正常上皮组织,研究发现SDC2 基因在结肠直肠癌组织中出现甲基化,其特异性达93.3%,且其在结直肠腺瘤中SDC2 甲基化水平亦明显升高。根据本研究的实验结果发现,结直肠癌、结直肠腺瘤的SDC2 基因甲基化检出率分别为76.00%(19/25)、80.00%(16/20),与既往研究基本一致,提示粪便中SDC2 甲基化检测对于结直肠癌早期及癌前病变诊断具有重要临床价值。
SEPT9 基因主要定位于人类染色体的17q25.3,其包含17 个外显子,是广泛存在于各类真核细胞中保守基因家族的一员。研究表明,SEPT9 基因在受到干扰后,会通过多条信号通路使肿瘤血管生成的速度加快,同时癌细胞增殖的速度也会加快,从而抑制了癌细胞的凋亡［16,17］。SEPT9 基因调控区域含有CpG 岛,CpG岛甲基化程度加深会阻碍SEPT9 基因表达,从而导致抑癌表达功能有所丧失,故SEPT9 基因的甲基化程度未来会成为诊断结直肠癌的主要生物标志物。又有研究发现,粪便的 DNA 分子标志物检测敏感性较高,且远高于外周血游离SEPT9 基因甲基化标志物检测敏感性,特别是对于早期发现结直肠癌,这个结果值得更深层次地探讨［18］。赵慧霞等［19］在126 例结直肠癌患者切除术中发现,对患者的癌组织、癌旁组织以及术前粪便中的DNA 所进行的SEPT9 基因甲基化检测结果表明甲基化程度一致,即结直肠癌患者的粪便SEPT9基因甲基化程度与患者癌组织中甲基化程度一致。两类患者临床上各时期检查无差别的情况也提示粪便基因SEPT9 甲基化检测对于结直肠癌早期及癌前病变诊断具有一定的临床价值。本研究中的结直肠癌患者的SEPT9 基因甲基化检出率较低,仅为16.00%(4/25),结直肠腺瘤检出率也较低为5.00%(1/20),且三组比较差异无统计学意义(P＞0.05),与既往研究结果存在差异。
多数研究均提示,检测粪便中的SDC2 基因甲基化程度具有较高的临床价值,该检测方式更加便捷、创伤性更低、检测速度更快,对于未来结直肠癌、癌前病变患者的筛查、早期诊断意义重大［20］。结肠镜结合病理检查是结直肠癌及癌前病变诊断的金标准,结合SDC2 基因甲基化检测可筛选、提醒患者需要行结肠镜检查,避免结直肠癌到晚期才被发现,从而明显降低死亡率。结肠镜检查由于多种原因导致结直肠腺瘤漏诊率＞20%,结合SDC2 基因甲基化检测可使医生及患者避免一些人为因素,亦可依据甲基化检测结果指导患者下次复查结肠镜时间,降低结肠镜检查漏诊率。
综上所述,粪便中SDC2 基因甲基化程度有利于筛查、早期诊断结直肠癌,对于癌前病变更好地发现、追踪。因此,粪便中SDC2 基因甲基化程度是一个重要的分子指标,使结直肠癌的筛查、诊断更加便利、无创、快捷；
SEPT9 基因的甲基化状态敏感性较低,检测发现的可能性较小,因此仍需要扩大样本量,多中心、多研究进一步证实其在结直肠癌早期诊断及筛查中的作用。