李圆圆 ，张 可 ，黄四洲 ，张利娟 △
1.成都医学院第二附属医院·核工业四一六医院 神经内科（成都 610057）；
2.成都医学院基础医学院 人体解剖与组织胚胎学教研室（成都 610500）；
3.成都医学院 发育与再生四川省重点实验室（成都 610500）
疾病、创伤及药物毒性等所致的耳蜗机械感觉毛细胞损伤是造成永久性耳聋及听力缺陷的常见原因，其原因是由于哺乳动物毛细胞不可再生[1]；
相反，某些脊椎动物如鸟类、两栖类动物及鱼类等的毛细胞则具有极强的再生能力[2]；
因此探明低等动物毛细胞再生的机制并加以运用，哺乳动物体内毛细胞再生则有望实现。斑马鱼侧线神经丘作为感受水压、水温及水流等的重要感觉器官广泛分布于头部及躯干表面，分为头部前侧线系统及躯干部位的后侧线系统[3]。由于神经丘中心的机械感觉性毛细胞具有较强的再生能力，在结构及功能方面与哺乳动物内耳毛细胞具有相似性，可用于活体染色且易于观察，并且斑马鱼具备易培育、繁殖快、产卵量大、胚胎透明等优点，故可作为毛细胞发育与再生的理想模型。
斑马鱼侧线系统起源于头部神经侧线基板，在向尾部迁移途中逐渐沉积形成一系列神经丘。每个神经丘由中央的一组机械感觉毛细胞及其周围非感觉性支持细胞围绕组成，其中毛细胞对氨基糖苷类抗生素及某些重金属如顺铂类、铜离子等十分敏感[4]。既往研究[4-6]通过线粒体荧光染料特异性标记斑马鱼侧线神经丘毛细胞，发现不同浓度梯度的新霉素或硫酸铜对毛细胞的损伤程度及损伤后再生过程均不相同。有研究[7]表明，在神经丘再生过程中新生毛细胞来源于周围支持细胞，然而调控这一分化过程的分子及细胞学机制不明；
同时药物或重金属是否会对毛细胞周围的支持细胞产生影响尚不清楚。因此本研究通过碱性磷酸酶催化底物氯化硝基四氮唑兰（nitroblue tetrazolium chloride，NBT）及5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，BCIP）反应显色方法显色神经丘[8]，探究不同发育时期斑马鱼侧线神经丘的发育状态，并用药物处理杀伤神经丘支持细胞，观察不同时期神经丘支持细胞对药物的敏感性及其损伤后的再生情况，以期为今后进一步探索神经丘再生调控机制奠定实验基础。
1.1 实验动物
本研究选用的斑马鱼为野生型（AB品系），养殖于经紫外线杀菌的恒温（28.5 ℃）系统水中，pH值恒定在7.6左右，保持规律的昼夜交替节律，严格按照标准饲养。成年斑马鱼交配前1 d 喂食后，将雌、雄鱼分别放置于中间有透明挡板分隔的交配缸中，次日8∶00拔除挡板，使其自行交配产卵。1 h后收集鱼卵于系统养殖水中，并放置于28 ℃恒温箱中孵育，于受精后24 h加入 0.03%苯硫脲抑制黑色素形成，分别收集受精后1～5 d不同发育时期的斑马鱼胚胎。
1.2 主要试剂及设备
NBT/BCIP显色液购自美国Roche公司；
新霉素（USP级）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；
五水硫酸铜晶体购自成都科隆化学品有限公司；
荧光显微镜购自日本Olympus公司。
1.3 实验方法
1.3.1 斑马鱼侧线神经丘NBT/BCIP显色 分别将受精后1～5 d时期斑马鱼胚胎各20个置于EP管中（受精后1～2 d的斑马鱼胚胎先剥去卵壳），加入4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）室温固定1 h；
用含有吐温的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline with tween，PBST）洗涤3次，5 min/次，将斑马鱼胚胎转移至36孔板中，加入配制好的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）缓冲溶液洗涤 3次，5 min/次；
将0.1 mL NBT/BCIP显色液加入4.9 mL AP缓冲液中混匀，37 ℃避光孵育20 min，每孔加入上述配制的显色液300 μL置于37 ℃温箱显色10～15 min；
4% PFA洗涤终止染色，再加入PBST洗涤1次，显微镜下观察，分别对每个斑马鱼胚胎头部及躯干部位神经丘进行计数并记录，将胚胎置于0.7%琼脂糖凝胶中固定，荧光显微镜拍照。
1.3.2 斑马鱼侧线神经丘药物处理 新霉素加入系统水中分别配制成浓度为125、250、500 μmol/L的溶液，将受精后2～4 d的斑马鱼胚胎分别置于培养皿中并加入上述溶液（每盘45个），每个时期均用3种浓度梯度溶液处理，置于28 ℃恒温箱中1 h；
蓝色五水硫酸铜晶体加入系统水中配制成浓度为 5、25、50 μmol/L的溶液，余方法同上。药物处理后每盘取15个胚胎转移至EP管中并立即用PBST洗涤3次，5 min/次，加入 4% PFA室温固定 1 h 后，进行神经丘NBT/BCIP显色（方法同前），观察每个时期不同浓度药物处理后斑马鱼侧线神经丘的变化并拍照。同时将每盘剩余胚胎培养皿中的溶液吸净，加入系统水清洗2～3次，将斑马鱼胚胎继续置于系统水中恒温孵育。
1.3.3 斑马鱼侧线神经丘的再生过程 选取经“1.3.2”方法获取药物杀伤效果较好的斑马鱼胚胎，将此时期的胚胎药物处理24 h后，每盘分别取出15个胚胎进行固定、显色；
剩余胚胎在药物处理72 h后进行固定、显色（方法同前），观察拍照。
2.1 斑马鱼不同时期的侧线神经丘发育
NBT/BCIP显色结果显示，受精后1 d斑马鱼胚胎的头部及躯干部位神经丘均未见显示；
在受精后2 d斑马鱼胚胎的头部及躯干部位神经丘均可见，但形态较小且数量较少；
受精后3 d斑马鱼胚胎的神经丘显示清晰，且数量较前明显增加、形态趋于规则；
受精后4 d斑马鱼胚胎的神经丘数量较前进一步增加且形态规则为中空的类圆形结构；
受精后5 d斑马鱼胚胎的头部及躯干部位神经丘数量及形态较受精后4 d未见明显改变（图1）。
图1 斑马鱼不同时期的侧线神经丘发育
2.2 不同药物处理不同时期斑马鱼侧线神经丘的变化
新霉素处理不同时期斑马鱼胚胎后结果显示，受精后2～3 d斑马鱼胚胎经500 μmol/L 新霉素处理后神经丘显色未见明显改变；
受精后4 d斑马鱼胚胎经125、250、500 μmol/L 新霉素处理后其头部及躯干部位神经丘均可见明显改变，表现为神经丘形态极不规则且明显变小、部分呈碎裂状改变，但均未完全消失，且不同浓度梯度间差异不明显（图2）。
图2 新霉素处理不同时期斑马鱼侧线神经丘的形态变化
硫酸铜处理不同时期斑马鱼胚胎后结果显示，受精后2～3 d斑马鱼胚胎经不同浓度硫酸铜处理后神经丘显色未见明显改变；
受精后4 d斑马鱼胚胎经5 μmol/L硫酸铜处理后神经丘形态未见明显改变，而经25、50 μmol/L 硫酸铜处理后其头部及躯干部位神经丘均表现为形态极不规则且明显变小、部分呈碎裂状改变，但均未完全消失（图3）。
图3 硫酸铜处理不同时期斑马鱼侧线神经丘的形态变化
2.3 不同药物处理后斑马鱼侧线神经丘的再生情况
受精后4 d斑马鱼胚胎在新霉素杀伤后24 h，125 μmol/L 新霉素处理组斑马鱼胚胎的头部及躯干部位神经丘形态完全恢复至正常，与杀伤后72 h差异不明显；
而250、500 μmol/L处理组斑马鱼侧线神经丘部分恢复，但未恢复至正常形态；
新霉素杀伤后72 h时250、500 μmol/L处理组斑马鱼侧线神经丘均完全恢复至正常形态（图4）。受精后4 d的斑马鱼胚胎在硫酸铜杀伤处理后24 h时，25、50 μmol/L处理组斑马鱼胚胎的头部及躯干部位神经丘形态均较前未见恢复；
杀伤后72 h时，25、50 μmol/L处理组斑马鱼胚胎的头部及躯干部位神经丘均完全恢复至正常形态（图5） 。
图4 新霉素处理后斑马鱼侧线神经丘的再生情况
图5 硫酸铜处理后斑马鱼侧线神经丘的再生情况
斑马鱼侧线神经丘随着胚胎发育逐渐成熟，在受精后48 h形成初级侧线系统[9-10]。基于此，本研究通过对斑马鱼胚胎行NBT/BCIP显色，结果发现受精后2 d斑马鱼前、后侧线神经丘开始显示，但数量较少且形态极不规则；
从受精后3 d开始神经丘数量呈现快速增长；
受精后4～5 d数量不再增加且呈现出较为规则的中空类圆形结构，符合神经丘的结构特点，即中央的毛细胞未着色，而分布于外围的支持细胞明显着色。该结果提示，受精后4 d斑马鱼侧线神经丘形态结构才基本发育成熟。
有研究[5]发现，新霉素对斑马鱼侧线神经丘毛细胞的损伤呈剂量依赖性，药物浓度为125 μmol/L时损伤较为明显，达500 μmol/L 时毛细胞被彻底清除。本研究中不同浓度梯度（125、250、500 μmol/L）的新霉素对受精后2～3 d斑马鱼胚胎的神经丘形态及数目均未产生影响；
而受精后4 d神经丘则变小且呈现出明显的形态异常，各浓度间差异不明显，经较高浓度（25、50 μmol/L）硫酸铜处理后的神经丘也呈现出同样的改变。其原因可能是未成熟的神经丘支持细胞尚未形成规则的结构，导致其损伤后与损伤前显色差异不明显，或是发育成熟的神经丘支持细胞对有害物质更为敏感所致。该结果提示，选择受精后4 d及以后时期的斑马鱼胚胎进行神经丘损伤及再生研究更为可靠。本研究还发现，受精后4 d的斑马鱼胚胎经5 μmol/L 硫酸铜处理后神经丘形态并未出现明显破坏；
而既往研究[6]发现，同样浓度的硫酸铜处理1 h，可致神经丘毛细胞全部清除，提示与毛细胞相比，外围的支持细胞更不容易受到重金属物质的影响。由此得出，不同浓度梯度的新霉素对斑马鱼侧线神经丘均有较好的杀伤效果，而较低浓度硫酸铜则无明显杀伤效果，相比之下，新霉素可作为斑马鱼侧线神经丘杀伤的最佳药物。
侧线毛细胞暴露于有毒物质后再生迅速，通常于损伤后24 h达增殖高峰，72 h几乎完全更新[11]，此过程受性别决定基因相关转录因子2、音猬因子等多种基因及Wnt/β-连环蛋白通路、纤维母细胞生长因子等信号通路调控[12-13]。有研究[14]表明，支持细胞作为毛细胞的前体细胞，通过增殖、分化促使毛细胞更新，并不会破坏其自身的数目及稳定性；
如果抑制支持细胞增殖，将导致毛细胞无法再生。本研究发现，125 μmol/L新霉素处理组斑马鱼侧线神经丘形态于损伤后24 h基本恢复，而250、500 μmol/L新霉素处理后24 h有部分恢复，72 h时才完全恢复至正常形态。既往研究[5]发现，经新霉素处理后毛细胞的再生呈剂量依赖。本研究中硫酸铜处理组在损伤后24 h与新霉素处理组相比，其神经丘恢复不明显，于72 h时完全恢复。由此得出，新霉素处理组斑马鱼侧线神经丘再生速度较快，125 μmol/L 新霉素在杀伤后24 h斑马鱼侧线神经丘形态已完全恢复，故125 μmol/L 新霉素可作为建立神经丘损伤及再生模型的最佳药物浓度。既往研究[15]发现，顺铂诱导的毛细胞损伤后再生速率与新霉素相比有所减慢，提示重金属物质在一定程度上可延缓再生过程。有研究[11]表明，硫酸铜浓度达到50 μmol/L时毛细胞将不能再生，但本研究结果显示，50 μmol/L硫酸铜处理1 h，神经丘形态仍完全恢复，提示较高浓度的硫酸铜才可导致支持细胞耗竭。
综上所述，受精后4 d的斑马鱼侧线神经丘形态结构发育基本成熟，这一时期的胚胎药物处理后进行损伤及再生方面研究其结论更为可靠。本研究全面呈现了不同浓度梯度的新霉素及硫酸铜致斑马鱼侧线神经丘的损伤及再生过程，但缺乏毛细胞特异性标记，后续的研究将结合毛细胞的再生过程探索再生相关调控机制。
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