万一夫，杨瑞琴*，张冠男，徐若沦
（1．中国人民公安大学 侦查学院，北京 100038；
2．公安部物证鉴定中心，北京 100038；
3．广东省毒品实验技术中心，广东 广州 510230）
气相色谱－质谱（GC－MS）是法庭科学领域中最常用的检验技术之一，被广泛应用于爆炸物、毒品、毒物、农残等物质的检验［1－9］。该技术包含多种电离源形式，其中，电子轰击电离源（EI）或化学电离源（CI）可用于检测有机炸药［10］。EI模式下产物离子的碎片化程度高，种类丰富［11］；
CI模式下色谱峰种类较少，背景噪声小，对梯恩梯（TNT）的检出限可达190 pg［12］。在多反应监测（MRM）扫描模式下，气相色谱－三重四极杆质谱（GC－TQMS）通过选择多对特定的母离子和子离子进行检测，可减少其他碎片离子的干扰。GC－TQMS结合了气相色谱优秀的分离能力和质谱技术强大的定性能力，灵敏度高，受基质干扰小，普适性强，分析速度快，与现场复杂环境下痕量有机炸药残留物检验分析的需求高度契合。
苦味酸（TNP）又称黄色炸药，猛度为103%TNT，在第一次世界大战前被用作弹头装药，是军用炸药中的常见成分［13－14］。TNP在当今社会中应用十分广泛，在农业领域可用作杀菌剂，在医疗领域可用于动物标记等［15］。然而，TNP是一种十分危险的硝基芳香族有机化合物，爆炸威力大，且具有强烈的肝毒性和血毒性［16－17］。由于含有酚羟基，TNP易溶于水，极易污染环境，因此建立TNP的高灵敏检测方法十分必要。
目前TNP的检测方法包括荧光分析法［18］、液相色谱－质谱法［19］、伏安法［20］、拉曼光谱法等［21］，相比于其他方法，GC－MS是公安基层刑事技术部门列装度最高的设备，利用率高，是检测TNP的有力手段。但TNP的极性强、沸点高，常规的GC－MS法难以直接检测［22］，因此需借助衍生化方法。以往研究中，次氯酸钠衍生化法最为常用，其原理是次氯酸钠在水溶液中水解生成次氯酸，随后将苦味酸氧化生成氯化苦［23］。但次氯酸的氧化性较强，可与多种硝基酚类、甲基酚类化合物反应生成氯化苦［24］。Merlet等［25］研究发现硝基甲烷、甘氨酸、腐殖酸均可与次氯酸反应生成氯化苦，此类杂质产生的副反应可能导致假阳性结果。因此，需要建立更准确定性苦味酸的方法。
较为理想的衍生化路径是：保留苦味酸主体结构，同时提升检验灵敏度，从而避免其他硝基酚类化合物和常见有机炸药的干扰。根据文献报道，烷基原碳酸酯与苯酚反应会生成苯基烷基醚，该反应的产率和反应物的化学结构有关，当酚羟基邻位或对位存在给电子基团（如烷基）时，由于屏蔽效应，产率下降；
存在吸电子基团（如硝基）时，产率增至80%～90%，而TNP酚羟基的邻位和对位均有强吸电子能力的硝基，为建立新的TNP衍生方法提供了思路［26］。原甲酸三甲酯（TMOF）是一种烷基原碳酸酯，常用作有机反应的脱水剂，能溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。同时，TMOF具有良好的反应活性，是一种重要的有机合成中间体，可用于还原芳烃卤代物［27］；
与醛、β酮酯等反应生成缩醛和缩酮［28－29］，可用于药品、染料和香料等的合成［30］，该类物质能与酚类在温和条件下反应生成芳基烷基醚，产率可达80%以上［31］。本文选用活性较高、价格低廉的TMOF对TNP进行衍生，得到的衍生产物2，4，6-三硝基苯甲醚（TNA）在GC－MS检测中具有较高的响应，据此建立了快速检验爆炸案件中苦味酸的GC－TQMS方法。
1.1 试剂与仪器
甲醇、丙酮、乙腈（色谱纯，Supelco公司）；
甲苯、乙醚、吡啶（分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司）；
原甲酸三甲酯（纯度98%，Aladdin公司）；
TNP、TNT、地恩梯（DNT）、黑索金（RDX）、特屈儿（CE）标准溶液（1 000 μg/mL，AccuStandard公司）；
泥土取自某公园，风干干燥后过60目筛备用。
Agilent 7890A－7010 GC－TQMS气质联用系统，配备CI源和EI源，HP－5MS（8 m×0.25 mm×0.25 μm）、HP－5MS（5 m×0.25 mm×0.10 μm）色谱柱；
Gerstel MPS自动进样器（Gerstel公司）；
ML204T/02分析天平（Mettler Toledo公司）；
移液枪（Eppendorf公司）；
有机微孔滤膜（0.22 μm）；
SB25－12DTD型超声波清洗器（宁波新芝公司）；
DHG－9245A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；
DZF－6032真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。
1.2 工作液及衍生方法
工作液：用甲醇将TNP标准溶液稀释至10 μg/mL，用于衍生化条件优化，并继续逐级稀释，用于实验和方法评价；
用甲醇将TNP、TNT、DNT、RDX、CE的标准溶液混合配制为10 μg/mL的混标工作液，用于提取回收实验。
衍生方法：取苦味酸待测液1 mL，用真空干燥箱处理后加入100 μL TMOF，超声振荡溶解2 min后密封，加热至95℃，保持70 min后取出样品冷却，加入1 mL甲醇振荡溶解，取1 μL上清液进样。
1.3 仪器条件
EI模式：采用HP－5MS毛细管色谱柱（5 m×0.25 mm×0.10 μm），恒压：75.84 kPa；
进样口温度：240℃，初始温度为80℃，保持1 min，以20℃/min升至250℃，保持0.5 min；
不分流进样，进样量：1 μL；
传输线温度：230℃；
电离能量：70 eV；
离子源温度：230℃；
载气为高纯氦气，碰撞气为氮气，质量数扫描范围35～400 amu，溶剂延迟1 min。
负化学电离（NCI）模式：采用HP－5MS毛细管色谱柱（8 m×0.25 mm×0.25 μm，自行切割），恒流：1.2 mL/min；
进样口温度：220℃，初始温度为50℃，保持1 min，以20℃/min升至250℃，保持2 min；
不分流进样，进样量：1 μL；
传输线温度：230℃，离子源温度：150℃，载气为高纯氦气，反应气为甲烷，质量数扫描范围35～400 amu，溶剂延迟3 min。
1.4 回收率实验
取公园中泥土，干燥后过60目筛备用。采用外标法，进行5组平行对照实验，实验组每份取泥土2 g，添加1 mL质量浓度为10 μg/mL的混标工作液，自然挥干5 min。加入20 mL丙酮，振荡提取约30 s，静置2 min，提取液沿玻璃棒引流至滤纸漏斗中，用50 mL烧杯收集滤液，自然挥干至1 mL左右，过有机滤膜，取100 μL滤液于进样瓶的内衬管中按照“1.2”方法进行衍生。对照组为“1.2”制备的混标工作液。
2.1 衍生化反应原理
在加热条件下，TNP与TMOF发生甲基化反应，生成2，4，6-三硝基苯甲醚、甲醇和甲酸甲酯，反应后得到淡黄色溶液。
图1显示了苦味酸的衍生化反应机理。反应过程中，原甲酸三甲酯与苦味酸发生亲核取代反应，脱去1个甲醇分子形成中间体A，由于碳原子同时连接1个芳氧基和2个甲氧基，中间体A结构不稳定，在加热条件下A很容易脱去1个甲酸甲酯分子。Smith［26］认为这主要是芳氧基引起，另外，由于芳氧基共振，中间体A很可能发生如图1所示的电子转移。中间体A脱去甲酸甲酯分子会产生芳氧基自由基、甲基自由基，二者结合生成TNA。此外，芳氧基苯环上对位和邻位的3个硝基使芳氧基的吸电子诱导效应增强，使得中间体A更容易分解，产率提高。
图1 原甲酸三甲酯与苦味酸的衍生反应机理Fig.1 Reaction mechanism for derivatization of TNP by TMOF
2.2 产物的确证
EI源是GC－MS最常用的电离源，由于能量较高，检测有机炸药时很难得到分子离子；
CI是一种软电离方法，图谱噪声小、分子离子丰度高。苦味酸含有多个硝基，吸电子能力较强，因此在NCI模式下的响应效果优于正化学电离（PCI）模式。为得到更好的分析效果，分别采用EI模式和NCI模式，通过保留时间和MRM离子对分析10 mg/L TNP的衍生产物TNA。
EI模式下TNA的谱图见图2，保留时间为2.76 min。质谱图中丰度较大的离子峰包括m/z243、213、166、105、75和62，m/z243来自［TNA］+（分子离子峰），该峰说明TNA的结构较稳定［11］；
m/z213来自［M－CH2O］+和［NO3］+；
m/z166可能是［M－CH2O］+继续脱去NO2的产物；
m/z105来自［M－3NO2］+；
m/z75和m/z62分别为［M－CH2O－3NO2］+和［NO3］+。选取丰度较高的离子［TNA］+和［M－CH2O］+作为母离子采集二级质谱，得到丰度较高的特征碎片离子m/z213［M－CH2O］+、166［M－CH2O－NO2］+和62［NO3］+。
图2 EI模式下TNP衍生产物TNA的总离子流图（A）和质谱图（B）Fig.2 Total ion chromatogram（A）and mass spectrum（B）of TNP-derived product TNA in EI mode
NCI模式下TNA的谱图见图3，保留时间为4.98 min。质谱图中TNA的碎片离子较少，无法获得分子离子峰，丰度较高的离子峰为m/z228、213，其中m/z228来自［M－CH3］-；
m/z213为［M－CH2O］-。选取m/z228作为母离子采集二级质谱，得到丰度较高的产物离子m/z198、m/z182，其中m/z198为m/z228继续脱去NO的产物［M－CH3－NO］-，m/z182则为m/z228继续脱去NO2的产物［M－CH3－NO2］-。
图3 NCI模式下TNP衍生产物TNA的总离子流图（A）和质谱图（B）Fig.3 Total ion chromatogram（A）and mass spectrum（B）of TNP-derived product TNA in NCI mode
2.3 衍生化条件的优化
原甲酸三甲酯接触水会发生反应，生成甲醇和甲酸甲酯，因此样品采用丙酮等溶剂进行提取。此外，原甲酸三甲酯易挥发，加热时，为避免其提前挥发导致衍生化反应无法进行，反应要在密闭条件下进行。
将TNP分别用甲醇、甲苯、乙腈、乙醚、丙酮和吡啶溶解后加入TMOF进行衍生，比较了不同溶剂的实验效果。结果表明，以甲醇作溶剂时TNA的响应最好，吡啶作溶剂时TNA的响应最差。
比较了苦味酸甲醇溶液和苦味酸固体的反应效果。实验表明，衍生化前对苦味酸进行干燥处理可大幅提高衍生化产率，这是因为直接加入TMOF一方面会使反应浓度降低，反应速率下降，另一方面，溶剂和TMOF会产生短暂的分层，苦味酸从溶剂相转移至TMOF（反应相）的过程减缓了反应速度。由于TNA的热稳定性强，烘干无明显影响，因此衍生前先对样品进行干燥处理。
进一步对反应时间、反应温度及TMOF体积进行了优化（图4）。结果表明，当反应时间为120 min时，TNA的信号强度达到最大，但只比70 min时高不到5%；
当反应时间超过120 min，TNA的信号强度随反应时间的增加而快速下降，这是因为产物TNA在长时间加热过程中随溶剂挥发所致。综合考虑时间成本和实验效果，选择反应时间为70 min。当反应温度为95℃时，衍生产物的相对信号强度最高，因此选择95℃为实验温度。此外，原甲酸三甲酯的沸点约104℃，实验中应防止温度过高导致液体暴沸。
图4 不同反应时间（A）、反应温度（B）、TMOF体积（C）下衍生产物的信号强度Fig.4 Signal intensities of derivatives under different reaction times（A），reaction temperatures（B）and volumes of TMOF（C）
在100～1 000 μL范围内，随着TMOF的加入量增加，TNA的信号强度降低，产率下降。这是因为在该范围内，产率和反应物的浓度成正比，因此进行衍生化反应时，TMOF的用量应尽可能减少。TMOF加入量进一步减少至50 μL时，产率反而下降，这是因为TMOF提前全部受热挥发导致反应不完全，因此TMOF加入量选择100 μL。
综上所述，最优衍生化条件为：将苦味酸待测液敞口置于真空干燥箱内烘干，加入100 μL原甲酸三甲酯，超声振荡溶解2 min。密封，放入烘箱加热至95℃，保持70 min，取出冷却，取1 μL上清液进样。
2.4 线性关系、检出限与定量下限
配制1～10 μg/mL的TNA单标溶液，绘制响应曲线以确定方法的线性范围，以信噪比S/N=3和S/N=10分别确定方法的检出限（LOD）和定量下限（LOQ），结果见表1。实验表明，仪器在EI模式下对TNA的灵敏度高于NCI模式，EI模式下的线性范围为5～1 000 μg/L，检出限和定量下限分别为1.33、4.78 μg/L，完全满足一般检测需要。
表1 GC－EI/TQMS和GC－NCI/TQMS的线性范围、相关系数、检出限及定量下限Table 1 Linear ranges，correlation coefficients，LODs and LOQs of GC－EI/TQMS and GC－NCI/TQMS
2.5 方法通用性
将本方法用于爆炸案件中有机炸药的检验，并对常见硝基芳香族有机炸药的影响进行了考察。分别配制10 μg/mL的TNT、DNT、CE、TNP单标甲醇溶液、100 μg/mL RDX的单标甲醇溶液，以及100 μg/mL的5种有机炸药的甲醇混标溶液（100 μg/mL），用“2.3”方法分别对单标溶液与混合标准溶液进行衍生处理后，取1 μL直接进样。实验采用EI源对5种有机炸药进行GC－TQMS检测，MRM所选离子对信息见表2。
表2 EI模式下5种有机炸药的MRM离子对及碰撞能量Table 2 Precursor and related product ions for analysis of 5 organic explosives in EI mode
实验表明，该方法下5种有机炸药的MRM特征峰基本不受影响，分离效果良好。对色谱峰进一步观察发现，在对照组和实验组中，TNT的保留时间分别为2.37、2.42 min；
DNT的保留时间分别为1.29、1.33 min；
RDX的保留时间分别为3.28、3.35 min；
CE的保留时间分别为4.17、4.15 min；
TNP衍生产物TNA的保留时间分别为2.82、2.84 min，说明该方法也可检测混合物中的TNP、TNT、DNT、RDX和CE。
2.6 实际应用
爆炸案件现场物证种类多样、分布复杂，爆炸泥土作为最常见的爆炸现场残留物，常作为司法鉴定领域判断炸药种类的重要依据。为考察泥土载体杂质的干扰，确定本方法的实战效能，对模拟爆炸实验残留泥土中的有机炸药成分进行了检验。按照“1.4”方法对模拟爆炸残留泥土进行提取回收实验，按照“1.3”中EI模式的条件将提取液和对照品分别检测，以实验组和对照组的色谱峰面积之比确定回收率，实验重复5次。结果显示，5次实验中均检出TNP，平均回收率为84.0%，相对标准偏差（RSD）为4.6%。以第3次实验为例，实验组样品的总离子流图如图5，可见该方法对复杂组分中TNP的检测灵敏度高、特异性强。
图5 爆炸泥土中TNA的总离子流图Fig.5 TIC for TNA in soil samples from simulating explosion
本文基于TMOF甲基化衍生法，建立了苦味酸的气相色谱－三重四极杆质谱高灵敏检验方法，在EI模式下对苦味酸的检出限达1.33 μg/L，高于NCI模式（5.02 μg/L），能够满足爆炸案件残留物的检验需求。采用灵敏度更高的EI模式，在该方法的基础上采用浸泡浓缩提取方法，可检出泥土样品中混合炸药的TNP组分，其平均回收率达84.0%。本方法对TNP具有良好的选择性，不受4种常见硝基芳香族有机炸药的影响，具有推广应用价值。
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