节笑笑 陈甜甜 张 月 陈旺宇 李 杰 郝旭亮
1.山西省中医药研究院中药方剂研究所，山西太原 030012；
2.山西中医药大学研究生院，山西晋中 030619；
3.山西中医药大学附属医院，山西太原 030024
肿瘤是威胁人类健康最主要的疾病之一，尤其是恶性肿瘤。据统计，我国每年恶性肿瘤的病死率约为11.94%[1]。目前，临床上常用的恶性肿瘤的治疗方法主要有放射疗法和药物化疗等，但这些经典的治疗方法在杀灭肿瘤细胞的同时也会杀伤机体正常细胞，降低其免疫功能，并且易产生耐药性，因此临床急需安全有效的肿瘤治疗方法。随着医药技术的不断发展以及对人体免疫系统更加深入的了解，运用免疫疗法治疗恶性肿瘤逐渐成为肿瘤治疗的新方法。但目前对免疫系统的认知尚不全面，若想要运用免疫疗法有效治疗恶性肿瘤，需要深入了解药物的作用机制及疾病的发病原理，深入探究免疫系统在疾病发展或治疗中是如何发挥作用的。基因缺失动物的出现使深入探究药物和疾病机制成为可能，其为免疫抗肿瘤的发展做出了巨大贡献。
基因缺失动物是指应用基因敲除技术和胚胎干细胞技术制作出来的，在个体基因组特定位点上的目的基因被删除或灭活的一类动物[2]。在所有基因缺失动物中，基因缺失小鼠的优势尤为明显，其一：小鼠为哺乳类动物，其生理和病理与人类有诸多相似之处；
其二：人类基因在小鼠中几乎都可以找到同源物[3]。现在基因缺失小鼠被应用在多种方面，如人类疾病动物模型方面、药物依赖性研究方面以及免疫学方面的应用等。本文就基因缺失小鼠在免疫抗肿瘤研究领域的应用做一综述。
由于传统肿瘤治疗方法会对机体造成极大伤害，因此人们迫切需要寻求新的肿瘤治疗手段。随着人们对免疫系统的深入研究，免疫抗肿瘤逐渐走进了人们的视野。免疫抗肿瘤不同于传统抗肿瘤之处在于免疫抗肿瘤是通过激活机体免疫系统，从而发挥其抗肿瘤作用，而非直接杀灭肿瘤细胞。
研究发现，许多药物都具有免疫抗肿瘤的作用，如天然多糖通过与Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）[4]、Dectin-1受 体（Dectin-1 receptor）[5]等受体结合激活免疫系统，从而发挥抗肿瘤的作用。青蒿素可增强乳腺癌的抗肿瘤免疫应答[6]；
索拉非尼等现代临床一线抗肿瘤药物既能直接杀灭肿瘤细胞，又能抑制血管内皮生长因子，从而延缓肿瘤的生长。
此外，还有一些尚在研发中的药物经过临床前研究发现其具有免疫抗肿瘤的作用，如NC318可抑制Siglec-15通路激活，活化免疫细胞杀灭肿瘤细胞[7]；
ABBV-151是GARP抑制剂，其通过抑制调节性T细胞（regulator T cells，Treg）释放活性TGF-β1以达到杀灭肿瘤细胞的目的[8]；
PY314可通过消耗免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞，促进抗肿瘤免疫，从而达到治疗肿瘤的目的[9]。
由此可见，随着人们对免疫系统的深入了解，免疫抗肿瘤的药物日趋多样化和精准化，免疫抗肿瘤正在逐步替代传统肿瘤治疗方法，成为肿瘤治疗的首要选择。
基因缺失小鼠是20世纪80年代后半期发展起来的，其原理是应用DNA同源重组技术使机体特定的基因失活或缺失。基因缺失小鼠常规制作技术主要有两种：基因打靶技术和基因捕获技术。第一次小鼠基因打靶实验于1989年完成，几十年来基因打靶技术的问世加速了人们对于基因功能的研究，并为生物学研究提供了重要的生物资源。2007年美国的Mario R.Capecchi、Oliver Smithies和英国的Martin J.Evans使用基因打靶技术使小鼠体内的特定性基因失活，培养出了使用价值极高的“基因缺失小鼠”，使他们获得了同年诺贝尔生理学/医学奖[10]。基因捕获技术是作为基因打靶技术的替代方法而开发出来的，它是一种高通量的和随机突变的技术，尽管不像基因打靶技术那样特异，但是通过诱捕可在短时间内制作出大量基因缺失小鼠[11]。
此外，还有条件基因缺失小鼠，条件基因缺失小鼠是指在小鼠发育的特定的阶段或特定的细胞组织类型中将目的基因进行敲除而得到的小鼠。条件基因敲除技术的本质是基于常规基因敲除技术，再通过重组酶Cre对特定位点进行特异性重组，可以对小鼠的基因组修饰进行时间和空间上的调控[12]。自1994年Gu等研制出全球第一例基于Cre/LoxP系统的特异性基因缺失小鼠，条件基因敲除技术便迅速取代了传统的完全基因敲除技术成为现代基因敲除的主流技术[13]。
目前，还有其他小鼠基因敲除方法，包括ZFN技 术[14]、TALEN技 术[15]、CRISPR/Cas9基 因 编 辑技术[16]等。2020年法国生物化学家Emmanuelle Charpentier和美国生物学家Jennifer A.Doudna研发了CRISPR/Cas9基因编辑技术，它对比于其他技术精度更高、成本更低，且方法更简单。这两位科学家也于同年获得了诺贝尔化学奖。郭洋等[17]利用CRISPR/Cas9技术成功构建PD-1基因缺失小鼠；
李振等[18]使用CRISPR/Cas9基因编辑、显微注射等方法成功构建β2m基因缺失小鼠；
王海杰等[19]利用CRISPR/Cas9技术成功构建凝血因子8基因缺失小鼠，为进一步实验提供了技术支持。
小鼠基因敲除技术为阐明生物体内基因的功能提供了有力手段。截至目前，已有近100种疾病模型由基因缺失小鼠构建，通过对这些模型的建立和深入研究，人们对许多疾病有了更加系统的认识并可由此寻找这些疾病新的更有效的治疗靶点。基因敲除小鼠技术的问世是生命科学领域内一项伟大的成就。
3.1 在药物治疗领域的研究进展
免疫抗肿瘤作为现代肿瘤治疗的热门方式，在对其研究中，基因缺失小鼠是不可或缺的实验对象，基因缺失小鼠使临床能够更加深入地探究药物在肿瘤治疗中是如何发挥作用的。
近年来多糖是免疫抗肿瘤领域研究的热门话题，许多植物多糖被证明具有免疫抗肿瘤的作用。余强[20]在对黑灵芝多糖的研究中应用TLR4基因缺失小鼠以及对照鼠来对比黑灵芝多糖治疗S-180肉瘤的能力，结果表明黑灵芝多糖提升了对照鼠的免疫水平，但对基因缺失型小鼠没有影响，这说明黑灵芝多糖是通过激活TLR4信号通路来发挥治疗S-180肉瘤的作用。刘艳玲等[21]在研究黄芪多糖对肺癌小鼠免疫功能影响时在实验中使用TLR4基因缺失小鼠，与对照鼠相比，基因缺失小鼠无论是模型组还是给药组，其炎性因子和蛋白表达之间的差异均无统计学意义，这恰恰说明了黄芪多糖是通过TLR4信号通路发挥抗肿瘤的作用，在TLR4基因缺失的小鼠体内黄芪多糖是无法发挥作用的。
除此之外，陈洁等[22]利用Dectin-1基因缺失小鼠和对照鼠构建荷瘤小鼠模型，使用β-葡聚糖进行治疗，结果显示经过治疗后基因缺失小鼠肿瘤生长速度明显高于对照鼠，这表明Dectin-1基因对β-葡聚糖抗肿瘤有影响，为后续研究奠定了基础。
由此可见，在寻求免疫疗法治疗肿瘤的道路上，基因缺失小鼠是必不可少的，在实验中相对于使用野生型小鼠而言，同时利用基因缺失小鼠及对照鼠，可以使药物机制更加明确，令实验结果更具说服力。总之，基因缺失小鼠对于药物机制的研究意义重大。
3.2 在非药物领域的研究进展
除了探究药物机制外，在非药物领域基因缺失小鼠也得到了广泛的应用。Katrin等[23]在对肿瘤监测的研究中使用Stat1缺失小鼠以及野生型小鼠，以此来探究NK细胞依赖性肿瘤监测，结果显示Stat1的缺失并没有取消NK细胞依赖性肿瘤监测，即两种小鼠所得结果差异无统计学意义。I-Ying等[24]在抗肿瘤研究中使用Rab37基因缺失小鼠及野生型小鼠，结果表明Rab37通过触发M2型巨噬细胞极化改变肿瘤微环境，发挥有效的抗肿瘤作用。Klara等[25]在探究细胞因子CDK6与肿瘤发生发展的关系中使用T细胞特异性CDK6敲除小鼠模型，结果显示CDK6在IFN信号传导中起双重作用，即CDK6既促进早期IFN反应，也参与负反馈回路的诱导，这表明CDK6在细胞因子反应的微调中发挥作用。
基因缺失小鼠除了可以探究肿瘤发病机制外，还有助于寻求更有效的治疗靶点。Ivana等[26]在对胰腺导管腺癌的研究中使用CDH11基因缺失小鼠以及对照鼠，无论是否使用药物治疗，CDH11基因缺失小鼠较对照鼠而言，其生存期更长、肿瘤体积更小，说明CDH11被敲除或抑制可以降低胰腺肿瘤的发展，并且延长小鼠的存活期。CDH11可能成为胰腺癌的治疗靶点。石秀珍等[27]在结肠癌的实验中运用MLL5基因缺失小鼠以及对照鼠制备小鼠荷瘤模型，结果显示MLL5基因缺失可抑制肿瘤生长，促进肿瘤免疫，MLL5可能成为结肠癌治疗的新靶点。
这表明无论是探究肿瘤发病机制，还是筛选肿瘤治疗靶点，基因缺失小鼠都是必不可少的，其贯穿于肿瘤从发生到治疗的始终。基因缺失小鼠对于人类认识肿瘤、治疗肿瘤做出了巨大贡献。
基因缺失小鼠的问世是人类医学史上的巨大进步，其对免疫学、肿瘤学等都有深刻的影响。基因缺失小鼠切实地帮助人类更直观地认识到药物是如何在机体发挥治疗作用的。
在人体生理病理以及药物作用机制的研究中，尤其是在基因以及通路的研究方向上，基因缺失小鼠的应用是十分重要的技术方法之一，其对比于野生型小鼠而言优势明显，但基因缺失小鼠造价高昂、制备困难，再加上目前技术有限，只能敲除一个或几个基因，而药物的作用往往是多方面的，这大大限制了基因缺失小鼠在实验领域的应用，随着基因技术的不断突破，相信在不久的将来，基因敲除领域会攻克难关，使基因缺失动物应用在更多实验研究中，尤其是在免疫抗肿瘤实验。肿瘤发病机制错综复杂，免疫系统让人难以捉摸，再加上药物治疗具有多通路、多靶点的特点，运用免疫疗法治疗肿瘤还有很长远的路需要走。
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