陈家琛， 陈 钢，戴嘉豪， 范福金，曹光球 ，曹世江
(1.福建农林大学林学院，福州 350002；
2.国家林业局杉木工程技术研究中心，福州 350002；
3.林木逆境生理生态及分子生物学福建省高校重点实验室，福州 350002；
4.洋口国有林场，福建 顺昌 353211)
【研究意义】光不仅是植物生长发育所必须的环境因子，而且是光合作用的能源[1]。植物的生长发育一方面受制于光子通量密度(PFD，Photon flux density)或光量，另一方面也受到不同波长的光即光质、光辐射与二者之间不同组分比例的影响。【前人研究进展】太阳光谱大致上可分为紫外光谱(UV<400 nm)、可见光谱即光合有效辐射(PAR，Photosynthetically active radiation，400～700 nm)和红外光谱(700～800 nm)，由于同温层(平流层)内O3的作用，大部分UV-B以及全部的UV-C无法到达地球表面，而到达地球表面的UV-B则因经纬度、日时间、季节变化、云层厚薄和其他环境因素而有所差异。例如，在自然条件下，照射在植物体上的光谱和光质会因天气而有所差别，阴天环境下蓝光最多，晴朗天气或傍晚红光最多[2]。植物会对生长环境的光质、光照时间长短、光强强弱，光照方向做出微妙反应，一旦光照条件发生变化，植物形态及光合作用便会产生适应性应答，并且不同发育阶段，不同植物的应答机理不一致[2-3]。蓝光、红光、远红外在调控植物光合生理和光形态中处于关键地位。光敏蛋白、隐花素、向光蛋白这些光受体接受光刺激，通过信号转导引起植物细胞激素水平、基因表达模式发生改变，从而调节植物物质代谢和水分代谢。已有研究证实，蓝光和红光处理下植物气孔导度会提高，而绿光则会降低气孔导度[4],大多数高等植物光合速率红光下最高[5]。由于光敏素能感受蓝光和紫外光、隐花素能感受蓝光和UV-A，因而蓝光下植物叶面积增大，有利于叶绿体的发育[6]。总之，不同光质或波长的光具有明显不同的生物学效应，不仅影响到植物萌发[7]，干物质积累和营养器官的生长，还影响叶片衰老[8]、抗逆性、基因表达[9]等。【本研究切入点】杉木[Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hook.]作为中国特色树种之一，广泛种植于长江以南地区，具备生长快速、高经济价值的特点，应用范围涉及家具、建筑、纤维工业，同时兼具药用价值，可做行道树。目前，对于光质的研究主要集中于绿豆[10]、莴笋[11]、青花菜[12]、番茄[13]等农作物，研究所得结果不尽相同，有些甚至得出相反结论，这可能归结于植物种类、光质处理方式和植物生长时间的差异。发光二极管(LED)因其波长专一性、寿命长、发热小等特色，为光质的选择提供了新思路[14]。LED光源在作物培育、花卉、水果以及蔬菜等方面广泛应用，对种苗快速生长[15]、产品质量提高[16]、观赏价值提高[17]、果实口感提高[18]均有明显作用。将LED用于幼苗培育虽有报道，但将LED用于杉木幼苗培育的相关研究除本课题组外尚未见其他人有相关报道。【拟解决的关键问题】本试验以杉木幼苗为材料，探寻不同光质下杉木幼苗叶绿体超微结构及光合生理特征，为杉木培育提供理论支持。
1.1 实验材料
供试杉木幼苗品种为洋口林场无性系020扦插苗，平均苗高21.6 cm，地径0.53 cm。
1.2 实验方法
采用LED红光(WLP=661 mm，FWHM=19.7 nm)、蓝光(WLP=454 mm, FWHM=20.1 nm)及其红蓝组合光1R1B(R∶B=1∶1)作为光源，共4种处理,即白光(CK)、红光(R)、蓝光(B)、红蓝光(R∶B=1∶1)。培养架为钢质结构，光源位于顶部，培养架外层用黑色遮光布遮挡。设置光强在100～110 μmol/(m2·s)，通过时控开关控制光照时间为12 h/d(6:00—18:00)，温度控制为(26±1)℃，湿度控制在65%左右，CO2浓度设置为大气浓度。
实验在福建农林大学田间实验室展开。杉木幼苗培养基质为草炭、珍珠岩、蛭石，体积比为0.46∶0.27∶0.27，将轻基质装入长×宽=55 mm×100 mm的纱布袋并置于塑料托盘，栽种前对基质进行浇水处理，保持适度湿润。缓苗2个月后置于LED灯下培养，选取生长健壮，长势一致的幼苗开展实验，实验期间做好幼苗管护。
1.3 测定项目和测定方法
1.3.1 光合参数的测定 每个处理随机选取18株长势均匀的杉木，取顶叶下方第3～4片功能叶，擦拭干净，每6株叶片测定值的均值为一个重复，共3个重复。于晴朗天气的上午9：00—12：00利用便携式光合系统(Li-6400XT LI-COR Biosciences American)测定幼苗叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间二氧化碳浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)。
1.3.2 叶绿体超微结构观察 上午9：00取第3功能叶片，用剪刀将功能叶剪至小于1 mm3保存至小瓶，用质量分数为2.5%戊二醛固定，PBS液漂洗3次(pH=7.2)，2%锇酸固定2 h之后，50%、70%、90%丙酮脱水，纯丙酮包埋。超薄切片机切至50～60 mm后，置于铜网，用染色剂进行双重染色(3%醋酸铀-柠檬酸铅)，放入透射电子显微镜(Tecnai G2 Spirit Biotwin FEI USA)观察拍照。
1.3.3 光合色素测定 光合色素采用80%丙酮法测定
1.4 数据处理
采用SPSS 21.0，Excel 2019 统计并分析所得实验数据，作图采取Origin Lab 2021版本；
采用最小显著性差异(LSD)多重比较与方差分析,显著性水平P<0.05。
2.1 不同光质对杉木幼苗光合特征的影响
2.1.1 光质对净光合速率(Pn)的影响 随着幼苗生长时间增加，叶片Pn表现为先迅速下降而后平缓的变化特点，90 d后各个处理间的差异总体变化不大。不同光质处理下Pn最大值均出现在第30天，以R∶B处理最大，达到3.82 μmol/(m2·s)，分别是W、R、B处理的1.04、1.83、1.71倍。此外，30 d各处理下Pn均显著高于60、90、120、150、180 d的相同处理(P<0.05)。任一发育天数内，R处理的杉木幼苗Pn均显著低于(P<0.05)其他处理。杉木幼苗发育的30～180 d之内，W、R、B、R∶B处理下杉木幼苗Pn分别降低224.77%、173.45%、173.17%、310.75%。杉木幼苗净光合速率总体表现为：R 2.1.2 光质气孔导度(Gs)的影响 由图2可知，Gs总体变化呈现出下降趋势，除R∶B处理外，各处理最大值均出现在60 d且W和R处理下Gs分别显著高于(P<0.05)B和R∶B处理，同时，60 d时R处理下Gs显著高于30、60、90、120、150、180 d时期R处理(P<0.05)。R∶B处理下除150和180 d无显著性之外，其余各发育天数对幼苗叶片Gs均显著高于150和 180 d。总体上不同处理间杉木幼苗叶片气孔导度总体表现为：CK>R∶B>B>R。 不同大写字母代表发育天数显著，小写字母代表不同处理显著，下同 图2 不同光质对杉木幼苗Gs的影响 2.1.3 光质对胞间CO2浓度(Ci)的影响 经过一段时间处理的幼苗Ci整体波动变化幅度不大。由图3可知，60 d时R处理下叶片Ci显著高于同一时期其余3种处理，而90 d时W处理下叶片Ci显著高于同一时期另外3种处理。同时，同为R处理的幼苗叶片Ci，60 d时显著高于其他发育天数下同为R处理的幼苗叶片Ci含量。同理，同为W处理的幼苗叶片Ci，90 d时显著高于不同发育天数同为W处理的幼苗叶片Ci。 图3 不同光质对杉木幼苗Ci的影响 2.1.4 光质对蒸腾速率(Tr)的影响 由图4可知，随着幼苗生长天数增加，杉木幼苗叶片Tr表现出下降的趋势，白光处理下的Tr总是高于其他处理。除R∶B处理外，其余3种处理均在60 d时达到最大值且60 d时4种处理下的幼苗叶片Tr显著高于90、120、150、180 d，同种处理下的幼苗叶片Tr，30 d时R∶B处理下幼苗叶片Tr显著高于60～180 d R∶B处理下的幼苗叶片。整个杉木幼苗发育期间，幼苗叶片Tr经过4种处理后分别下降133.33%、131.73%、208.98%、213.11%，以R∶B处理下降幅最大。 图4 不同光质对杉木幼苗Tr的影响 W、R、B、R∶B分别为白光、红光、蓝光、红蓝组合光处理下叶绿体超微结构； 对不同光质处理180 d的叶绿体超微结构进行观察得出，与CK(W处理)相比，红光处理下叶绿体中淀粉粒数量较少、体积小，呈梭形，然而结构完整，无明显变化。细胞壁完整并且仍然较为光滑。嗜锇颗粒少量出现，颗粒小。类囊体片层上垛叠薄，基粒片层的垛叠多，线粒体开始分解。蓝光处理下叶绿体细胞壁平滑，淀粉粒消失，但细胞壁厚薄不一，叶绿体无较大变化，沿细胞壁整齐单列分布，嗜锇颗粒数量少且颗粒小，基粒与基质片层界限清晰，呈规则分布，连续紧密，类囊体片层垛叠变厚，线粒体降解。红蓝复合光处理下叶绿体淀粉粒出现数量极少，叶绿体与蓝光类似均无明显变化。红蓝复合光处理下细胞壁结构更加完整且更加平滑，嗜锇颗粒大量出现且大量聚集，颗粒大，类囊体片层垛叠厚，基粒和基质片层结构清晰。 提取处理180 d杉木苗的光合色素，发现R∶B处理下的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量显著低于单色光处理，但显著增加了叶绿素比值。叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量及类胡萝卜素均以W处理最高，但W处理与R、B处理并无显著差别(表1)。 表1 不同光质对杉木幼苗叶片光合色素的影响 相关性分析表明，Pn、Gs、Ci、Tr在时间、处理及其两者间的交互均存在显著差异，时间、处理以及两者的交互对各指标有显著影响。Pn与Tr，Gs极显著正相关。Tr和Gs之间表现为极显著正相关(表2～3)。 表2 杉木幼苗不同光质处理及各指标间的方差分析 表3 杉木幼苗叶片各指标间的相关性分析 光合速率是影响植物产量的重要因子，相关研究表明，红蓝复合光(R∶B=1∶9)下油茶净光合速率(Pn)最大[19]； 叶绿体对外界环境的察觉十分明锐，有研究表明，高度逆境胁迫下叶绿体结构会发生不可逆的损伤，例如，类囊体膜解体、淀粉粒消失等[28]。叶绿体结构受损是引发光合作用降低的重要原因之一。而光合作用的减弱必然造成植物净光合速率下降。本研究通过电镜观察，R处理下淀粉粒分布较少且淀粉粒变小，对应着R处理下净光合速率降低，光合能力低。与曹刚等[29]对黄瓜的研究结果不一致，一方面是黄瓜属于被子植物，而杉木属于裸子植物，两者物种差别引起生理构造的区别。另一方面，曹刚研究中光强控制在50 μmol/(m2·s)左右，而本研究光强控制在100 μmol/(m2·s)。本研究中，蓝光处理下，类囊体片层垛叠厚，基粒片层与基质片层分布规则且连续紧密，这与张汝民[30]对绿豆的研究结果不一致。类囊体是光捕捉，电子传递，质子易位以及ATP酶合成位点，是光反应的场所[31-32]。因此，类囊体片层结构与植物光合能力关系紧密[33]。有学者就得出蓝光处理的绿豆其基质片层形成速度快于其他光质处理，却阻碍类囊体垛叠[30]。也有学者研究得出沙冬青幼苗叶绿体内叶肉细胞淀粉粒体积较小[34]。本试验电镜观察表明，红蓝复合光处理下细胞壁结构更加完整且更加平滑，淀粉粒体积小且数量少，嗜锇颗粒大量出现且大量聚集，颗粒大，类囊体片层垛叠厚，基质片层和基粒构造明确，这与曹刚等[35]的结果一致，这可能与光合作用相关的光合受体在类囊体上的功能启动和组装相关，并且红蓝复合光下基质片层、基粒非常清晰，基粒片层、基质片层及片层结构井然有序，为有效提升光合速率提供了保障。 光合色素能吸收、转化和传递光能，是植物进行光合作用的基础，其组分与含量直接影响叶片光合速率。许多研究报道，红光提高植物叶绿素含量，蓝光降低叶绿素含量[11]，增加叶绿素a/b值[36]。这与本文结果一致。本试验发现红蓝复合光下色素含量低于红、蓝单色光处理，可能是由于红蓝光互相抵消的效应导致。类胡萝卜素能帮助叶绿体吸收光能，避免高温、强光下的破坏[37]。本研究中红蓝组合光处理类胡萝卜素含量虽然显著低于单色光处理，但是净光合速率却高于单色光，这可能是由于类胡萝卜素大量吸收波长较长的红光，保护叶绿体免受高温伤害使得净光合速率高于单色光。蓝光下叶片类胡萝卜素降低，与闫萌萌等[25]在花生上的研究结果不一致。这主要归功于蓝光波长选择和物种不同，闫萌萌实验中选择蓝光段波长为445～470 nm，而本实验蓝光波长为454 nm，不同种类植物对光吸收偏好不同是导致两者出现差异的重要原因。 本实验结果表明，不同生长期和光质处理下的杉木幼苗，其光合参数、光合色素含量、叶绿体超微结构均有差别，说明不同光质配比和生长期对杉木幼苗会有显著影响。总的来看，蓝光及一定比例红蓝复合光下叶片光和参数，光合红色素含量高于其他单色光处理。红蓝复合光下细胞壁结构更加完整且更加平滑，类囊体片层垛叠厚，基粒和基质片层结构清晰，排列整齐。因此，蓝光以及一定比例的红蓝光是杉木幼苗良种壮苗较为理想的光质。
St：淀粉粒；
Hu：嗜锇颗粒；
Mi：线粒体；
Chl：叶绿体；
Cw：细胞壁；
Cm：叶绿体膜；
Th：类囊体；
Nu：细胞核；
GL：基粒片层；
S:基质片层2.2 光质对杉木幼苗叶绿体超微结构的影响
2.3 光质对光合色素的影响
2.4 各指标的方差分析和相关性分析
3.1 不同光质对杉木幼苗光合特性的影响
红蓝光比例为3∶1的情况下，Gs、Pn、Ci、Tr均达到最大[20]；
叶用莴笋在红蓝复合光为8∶1的情况下，Gs、Pn、Ci、Tr最大[21]。本文中，与红、蓝光相比，白光最有利于提升幼苗叶片净光合速率，其次为红蓝组合光。可能是白光诱使气孔开放的能力上优于红、蓝光[22]。红光处理与其他单色光和组合光相比，叶绿素含量较高，净光合速率最低，产生此种现象的原因可能是相对于红光而言，蓝光下叶片叶肉细胞淀粉粒积累较少[23]，红光会扼制叶片输出光合产物，增加叶片中的淀粉粒积累，而淀粉粒的过量积累会阻碍植物叶片光合作用的进行[24]。本研究得出，相较于其他处理，红光处理的幼苗气孔导度显然偏低，但胞间CO2浓度显然上升，表明植物细胞对CO2的利用能力弱，气孔导度和CO2利用效率的降低可能均是其净光合速率下降的原因[25]。红蓝组合光下净光合速率显著高于红、蓝单色光处理，可能原因是红蓝复合光处理减缓了叶绿素和类胡萝卜的衰减，同时也说明红蓝复合光提升杉木幼苗叶片净光合速率的能力优于蓝光和红光[26]。另外，本研究发现120 d蓝光处理下的杉木幼苗Gs显著高于同时期不同处理，可能是此时蓝光诱导向光蛋白PHOT1、PHOT2自磷酸化，进而使得BLUS1的348位点(ser-348)磷酸化，而BLUS1的磷酸化又引诱保卫细胞质膜H+-ATPase的磷酸化和激活，从而导致胞膜的超极化(hyperpolarization)，最终导致气孔开放[27]。3.2 不同光质对杉木幼苗叶绿体超微结构的影响
3.3 不同光质对杉木幼苗光合色素的影响