李静 梁亚萍 邹远妩 张思琪 郑见宝 仵倩红
2020年，全球共发现约1000万例结核病患者，其中20%的肺结核患者合并肺外结核(extrapulmonary tuberculosis, EPTB)，而肠结核约占EPTB患者的10%[1]。肠结核通常来自肠内原发病灶，临床症状与克罗恩病和肠癌等非常相似，易误诊误治、诊断延迟、治疗效果不理想[2]。肠结核诊断的金标准是肠黏膜组织标本培养出结核分枝杆菌[3]，但目前筛查较好的内窥镜技术(结肠镜检查和盲回肠活检)因其为侵入性检查而受到大多数患者的抵触[4]，而放射学检查中CT扫描或磁共振成像MRI)的诊断率又非常低，故临床诊断肠结核主要依赖于典型的临床症状和实验室检测。
传统的细菌学检测中抗酸杆菌涂片法快速、价格低但敏感度低，分枝杆菌培养周期长、不能满足临床早期快速诊治的需求，加之粪便标本载菌量又较少，两种方法的阳性检出率均较低，故寻求一种新的快速、准确且高敏感度、高特异度的实验室诊断方法一直是肠结核诊断的重要目标。GeneXpert MTB/RIF(简称“Xpert”)是以全自动半巢式实时PCR技术为基础，以rpoB基因为靶基因，可在2 h内同时快速检测结核分枝杆菌和利福平耐药性，已作为新型分子诊断技术被很多研究者推荐用于EPTB的诊断[5-6]，但Xpert用于粪便样本的检测数据还相对有限，故笔者通过比较Xpert、浓缩集菌漂浮法涂片镜检(简称“集菌法”)、BACTEC MGIT 960液体培养(简称“MGIT 960培养”)对肠结核患者粪便标本的检测结果，进一步评估Xpert检测粪便标本对肠结核的诊断价值。
一、研究对象
回顾性收集2019年8月至2022年5月陕西省结核病防治院收治的135例疑似肠结核患者粪便标本的实验室检测资料，纳入同时对患者粪便标本采用集菌法、MGIT 960培养和Xpert检测的98例疑似肠结核患者，其中男性68例(69.4%)、女性30例(30.6%)。所有患者临床资料均来源于临床原始病例记录。
二、 研究方法
1.肠结核患者诊断依据[7]：(1)有发热、腹痛、腹泻、腹胀或腹泻与便秘交替等及伴有结核中毒症状；
(2)肠镜下发现有黏膜充血、水肿、环形溃疡，溃疡边缘不齐呈鼠咬状，伴有大小及形态各异的炎症息肉，肠腔变窄；
(3)病理切片可找到干酪样坏死；
(4)粪便或黏膜组织分枝杆菌培养阳性；
(5)诊断性抗结核治疗有效。符合第1条和(或)第2条，同时满足第3～5条中任意1条即可确诊。
2.主要试剂和仪器：抗酸染色试剂为实验室自配萋尼染色试剂；
MGIT 960检测系统所用培养仪及试剂均由美国BD公司提供；
Xpert MTB/RIF检测系统及配套试剂盒均购于美国Cepheid公司。
3.实验室检测方法：按照标本采集的要求收集留取粪便标本至少5 ml，每份标本均进行集菌法、MGIT 960培养和Xpert检测。(1)集菌法：严格按照《结核病实验室检验规程》[8]操作。将粪便标本用高压蒸汽(1.0 kg/cm2，121.3 ℃)灭菌30 min后，取出放冷，加入半瓶蒸馏水混匀于振荡器上振荡10 min，拿出后加入0.5 ml二甲苯充分振荡后静置，将蒸馏水添加至满而不溢，再盖上提前准备好的涂抹血浆(大小约为1×2 cm)的玻片，漂浮1 h后取下放置在玻片架上干燥后行萋尼染色镜检，按照检验规程报告结果。(2)MGIT 960培养：严格按照《结核病实验室检验规程》[8]操作。取2 ml粪便标本经N-乙酰-L-半胱胺酸-氢氧化钠法(NALC-NaOH；
终浓度为1.5%，原始浓度为6% NaOH)消化去污处理后，室温静置15 min，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH=6.8)中和后再以3000×g离心15 min，弃上清，2 ml PBS缓冲液重悬沉淀物，取0.5 ml重悬液接种至MGIT 960培养管中，加入0.8 ml营养添加剂(OADC)和杂菌抑制剂(PANTA)的混合液，严格按照说明书进行操作。将接种好的MGIT 960培养管放入MGIT 960系统中孵育，仪器对分枝杆菌的生长进行自动监测。MGIT 960培养仪报阳后经涂片镜检确定为分枝杆菌，再采用结核分枝杆菌抗原检测试剂盒(MPB64)进行结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的初步鉴定[9]。(3)Xpert检测：严格按照操作说明书进行检验。将1 ml粪便标本与2 ml Xpert MTB/RIF系统前处理液混合，拧紧瓶盖，涡旋振荡15 s，室温静置15 min，使标本充分液化沉淀后，3000×g离心3 min用无菌吸管吸取2 ml上清样品加入Xpert MTB/RIF系统测试盒中，上机检测，约2 h报告结果。
4.质量控制：(1)室内质控：有完整的实验室内部操作规程；
实验人员培训合格持证上岗；
试剂使用、配制做好相关记录，核对批号及使用期限；
仪器定期保养有使用、检测、维修等记录；
严把标本收集容器、性质、时间、保存的每个关口；
用已知阳性级别和阴性结果的涂片进行质量控制；
(2)室间质控：每年参加中国疾病预防控制中心室间质量评价、熟练度测试及北京联盟室间质评。
三、统计学处理
采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析。非正态分布的计量资料以“中位数(四分位数)[M(Q1,Q3)]”描述；
计数资料以“例(百分率，%)”描述，两组间差异的比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。以最终临床诊断为参考标准，评价集菌法、MGIT 960培养、Xpert技术的检测敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率，并进行一致性Kappa检验。其中Kappa值判定标准为：0
一、患者确诊情况
98例患者中，54例(55.1%)确诊为肠结核，其中男性42例(77.8%)、女性12例(22.2%)；
年龄范围为13～86岁，中位年龄[M(Q1,Q3)]为35(27，60)岁；
16例(29.6%)经粪便分枝杆菌培养阳性确诊，38例(70.4%)以临床表现、肠镜检查结果、抗结核治疗有效等临床综合诊断确诊。44例(44.9%)确诊为非肠结核，包括克罗恩2例、急性血行播散性肺结核6例、结核性腹膜炎7例、肠梗阻3例、恶性肿瘤3例、结核性胸膜炎7例、继发性肺结核13例、非结核分枝杆菌1例、泌尿系结核2例；
其中男性26例(59.1%)、女性18例(40.9%)，年龄范围为18～78岁，中位年龄为46(31，64)岁。
二、不同检测方法诊断肠结核的检测效能
98例疑似患者中，Xpert对肠结核的阳性检出率[38.8%(38/98)]明显高于集菌法[15.3%(15/98)]和MGIT 960培养[16.3%(16/98)]，差异均有统计学意义(χ2=25.496，P=0.000；
χ2=20.224，P=0.000)。其中，集菌法与MGIT 960培养同时阳性者9例，与Xpert同时阳性者16例，MGIT 960培养与Xpert同为阳性者15例。另外，Xpert对集菌法和(或)MGIT 960培养均阳性的54例肠结核患者粪便样本的阳性检出率为95.5%(21/22)，对二者均阴性粪便样本的阳性检出率为53.1%(17/32)。
以临床确诊患者为参照标准，集菌法、MGIT 960培养、Xpert对肠结核的检测敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和Kappa值见表1。
表1 不同检测方法以临床确诊为参照对肠结核诊断效能
肠结核是由结核分枝杆菌感染人体肠管而引发的慢性特异性感染性疾病，在发展中国家的患病率很高，也是我国重要的公共卫生问题[10]。肠结核在成年人中常见，由于肠结核早期多缺乏特异性临床表现，常导致诊断延误、误诊误治，增加不必要的手术风险，预后较差，严重影响患者生存质量，也增加了患者死亡率[11]。虽然传统的细菌学检测方法一直是结核病诊断的“金标准”，但由于存在各自局限，临床仍在寻求一种新的快速、准确且高敏感度和高特异度的检测方法。Xpert作为新型分子诊断技术，其在肺外结核中的诊断价值已被多项研究评估[12-20]，认为其在肺外标本如胸腔积液、脑脊液、骨关节结核部位脓液标本及尿液等的检测中均具有较高的敏感度，且检测方法优越，被认为是可用于肺外结核各种类型临床标本(如脑脊液和组织样本)的确证性诊断方法，但对于粪便标本检测效果的数据还较少。
本研究中，Xpert对肠结核的阳性检出率明显高于集菌法和MGIT 960培养，且对肠结核患者细菌学阳性粪便样本(即涂片和/或培养阳性)的阳性检出率为95.5%，对细菌学阴性(即涂片和培养均阴性)患者的阳性检出率为53.1%，这些均表明Xpert技术在肠结核诊断中具有明显优势。2018年，Rahman等[21]以培养为诊断标准评估了粪便标本抗酸杆菌涂片、L-J固体培养法和Xpert三种检测方法在肺结核中的诊断价值，发现三者敏感度分别为53.9%、35.3%和90.2%，特异度均为100.0%。而熊瑜等[22]以临床诊断为标准比较了粪便标本抗酸杆菌涂片、MGIT 960培养和Xpert三种检测方法，发现三者对肠结核的诊断敏感度分别为13.2%、43.2%和60.4%，特异度分别为98.3%、100.0%和100.0%。本研究也以临床最终诊断为参照标准比较了粪便标本集菌法、MGIT 960培养和Xpert检测的敏感度、特异度和Kappa值，发现Xpert检测粪便标本中结核分枝杆菌的敏感度(70.4%)明显高于其他两项方法(分别为27.8%和29.6%)，且具有较好的一致性(Kappa值为0.60)，提示Xpert检测敏感度明显高于培养和涂片法，且与临床诊断中、高度一致，与上述研究结果基本一致。虽然相关数据有差异，但可能与参考标准、患者类型、检测操作方法不同有关。MacLean等[23]进行了一项粪便Xpert诊断儿童结核病准确性的系统综述和荟萃分析，结果表明，相较于微生物学参考标准，粪便Xpert检测的综合敏感度和特异度分别为67%和99%，也符合本研究结果范围，说明Xpert检测粪便标本能够更好地辅助临床诊断。尤其是近几年在儿童、无痰或少痰及免疫功能低下患者中对疑似结核病患者进行了多项研究，期望能用粪便标本替代其他样本进行检测诊断，同时也对粪便样本的处理方式进行了探索，认为粪便样本有效处理技术对Xpert成功检测成人或儿童粪便标本中结核分枝杆菌是非常有效的[21，23-26]，对于消除PCR抑制剂和获得有效结果至关重要，认为Xpert检测粪便的方法可能对于评估无痰或留样不便利疑似患者的检测价值更有前途，对提高结核病快速诊断和治疗意义重大。
本研究中，MGIT 960培养的敏感度较其他文献报道偏低[21，23]，认为可能原因为：首先，MGIT 960培养对培养环境要求极高，实验前处理过程较为复杂，在前处理过程中损耗掉了一部分菌量，本研究粪便标本在处理过程中所用的消化条件与痰液相同，使粪便标本中的大多数结核分枝杆菌暴露于碱性环境中，也会使一部分结核分枝杆菌被杀死而失去活性，且加样量仅有500 μl，载菌量较低，从而也降低了MGIT 960培养的阳性检出率；
其次，本研究中大多数肠结核患者在留取标本之前已经在当地结核病机构进行了一段时间的抗结核药物治疗，结核分枝杆菌培养主要针对检测的是活的结核分枝杆菌，可能受抗结核治疗的影响较大，而Xpert主要检测的是结核分枝杆菌DNA，不能区分死菌和活菌，对其阳性检出率影响不大；
再次，由于肠结核患者的特殊性，难以确定留取粪便标本时间，也有可能降低阳性检出率。但偏低的MGIT 960培养阳性检出率并不会影响Xpert较高的阳性检出率，而且Xpert相较于其他两种方法，还具有检测时间短、可直接检测患者标本结核分枝杆菌及利福平是否耐药等优点，更有利于肠结核的早期诊断。
本研究也有一定局限：一是本研究虽然统计了近3年疑似肠结核患者粪便样本的检测情况，但因同时进行集菌法、MGIT 960培养和Xpert检测的患者数只有98例，样本量较少，未对其是否有过抗结核治疗等予以排除，可能会影响MGIT 960培养的阳性检出率；
二是由于实验室检测条件有限，对于MGIT 960培养与Xpert检测不相符的结果未能进一步进行基因测序验证；
三是研究未对阳性结果进行药物敏感性分析，这也将是下一步研究的重点；
四是Xpert检测粪便标本阳性并不代表可确诊肠结核，也有可能是肺结核患者吞咽了含有结核分枝杆菌的痰液[27]，这需要临床谨慎排查。虽然本研究有很多局限性，但由于目前诊断肠结核依赖于肠黏膜组织标本的培养，常因菌量少而难以检出，也易造成假阴性，故高敏感度和高特异度的粪便Xpert检测为临床诊断肠结核拓展了新思路，也有利于肠结核的早期诊断，认为将之与临床和常规检测相结合是值得临床尝试的新方法。
综上所述，Xpert检测粪便标本对肠结核早期诊断具有较高的敏感度和特异度，且高于传统的集菌法和培养法，能更好地辅助临床诊断；
而且非侵入性的收集方式也极大地减轻了那些不便于留取组织样本患者的痛苦，降低了结肠镜检查获取组织进行细菌学诊断的经济压力，并明显缩短了诊断时间，因此，对临床疑似肠结核患者，可优先选择Xpert检测粪便样本，对早诊断、早治疗及预防严重并发症有一定临床意义。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
作者贡献李静：实施研究，起草文章；
梁亚萍和邹远妩：分析/解释数据，统计分析；
张思琪：采集整理数据；
郑见宝：英文翻译，对文章的知识性内容作批评性审阅、指导；
仵倩红：酝酿和设计实验，对文章的知识性内容作批评性审阅，行政支持