袁 超， 杨 洋， 韩 勇*， 吴小敏， 粟朝芝， 王德凤
(1. 贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005；
2. 贵州省草地技术试验推广站，贵州 贵阳 550025)
羊肉膻味主要源于羊肉脂肪组织中的4-甲基辛酸和4-乙基辛酸支链脂肪酸，其含量多少直接影响膻味大小[1]。反刍动物瘤胃发酵食物产生的乙酸是脂肪酸合成的主要前体物质，在酶的作用下首先合成乙酰辅酶A(Acetyl coenzyme A，Ac-CoA)，然后在乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl CoA carboxylase，ACC)、激素敏感酯酶(Hormone sensitive lipase，HSL)的催化下合成长链脂肪酸、甘油、脂肪酸[2]。脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，FAS)作为1种内源性脂肪酸合成的关键酶，能将乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A等小分子碳单元聚合成长链脂肪酸[3，4]，FAS基因是影响山羊膻味和肉品质的关键候选基因[5]。目前关于FAS基因的研究主要集中在人、小鼠、绵羊和猪等动物，关于贵州黑山羊的研究还未见报道。本研究对贵州黑山羊FAS基因CDS区进行克隆与生物信息学分析，并利用qRT-PCR技术检测FAS基因在贵州黑山羊各组织中的表达情况，为后续相关研究奠定基础。
1.1 材料采集贵州省畜牧兽医研究所麦坪基地饲养的3只(3月龄)贵州黑山羊公羊的心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、背最长肌、腿肌、脂肪组织作为试验材料。
1.2 主要试剂RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒、T4 DNA连接酶(美国Thermo Fisher公司)，质粒提取试剂盒购、胶回收试剂(美国AxyGen公司)，DNA Marker、Sso Fast Eva Green Supermix[宝生物工程(大连)有限公司]。
1.3 主要仪器PCR仪(型号：C1000 Touch T，美国 BIO-Rad公司)、微量紫外分光光度计(型号：Nanodrop 2000，美国Thermo Scientific公司)、恒温振荡培养箱(型号：HZQ-F160，太仓华美生化仪器公司)、荧光定量荧PCR仪(型号：CFX96，美国 BIO-Rad公司)。
1.4 方法
1.4.1 总RNA的提取按照RNA提取试剂盒说明书方法，分别提取贵州黑山羊的心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、背最长肌、腿肌、脂肪组织的总RNA。-80 ℃保存备用。
1.4.2 cDNA的合成用无RNA酶去离子水将各组织样品的总RNA浓度稀释至500 ng/μL，按照cDNA反转录试剂盒说明书方法合成cDNA第一链。反应体系20 μL：模板RNA 1 μL、Oligo(dT)18 primer 1 μL、Nuclease-free Water 10 μL、5×Reaction Buffer 4 μL、RiboLock RNase Inhibitor 1 μL、dNTP Mix(10 mmol/L)2 μL、RevertAid M-MuLV RT 1 μL。反应程序：65 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min。cDNA模板于 -80 ℃保存备用。
1.4.3 引物设计与合成参考GenBank山羊FAS基因(登录号：NM_001314235.1)mRNA序列，利用Primer Premier 5.0软件设计FAS基因CDS区PCR、qRT-PCR特异引物，以GenBank山羊GAPDH基因(登录号：XM_005680968.3)为内参基因。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物信息见表1。
表1 引物信息
1.4.4FAS基因的克隆鉴定以脂肪组织的cDNA为模板，以FAS-F、FAS-R为引物进行PCR扩增。PCR体系30 μL：PremixTaq15 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各1.5 μL，cDNA(100 μg/ μL)模板2 μL，ddH2O 10 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；
94 ℃变性45 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；
72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，按胶回收试剂盒说明书方法回收PCR产物，纯化后与PCR 2.1载体连接。连接体系10 μL：T4 DNA连接酶1 μL，纯化PCR产物7 μL，PCR 2.1载体1 μL，10×T4 Buffer 1 μL。连接条件：金属浴4 ℃连接过夜。将连接产物全部加至DH5α感受态细胞，混匀，冰浴30 min后42 ℃水浴90 s，再冰浴5 min，加入LB液体培养基800 μL，混匀，37 ℃ 200 r/min振荡培养1 h，取出后8 000 r/min离心3 min，弃上清，留200 μL吹打混匀，涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基，37 ℃培养12 h。挑取单菌落移入含3 mL A+抗生素LB液体培养基的离心管(10 mL)中，37 ℃ 200 r/min振荡扩大培养。经菌液PCR鉴定，阳性菌液按照质粒提取试剂盒说明书方法提取质粒，送上海生工生物工程股份有限公司测序。
1.4.5 序列结构分析从GenBank下载不同物种的FAS基因序列作为参考序列，利用BioEdit软件、Megalign软件分别对贵州黑山羊FAS基因进行序列比对与同源性分析，MEGA 6软件绘制系统进化树。使用在线软件ProParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析贵州黑山羊FAS蛋白理化性质，使用在线软件SOPMA(https:npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析FAS蛋白二级结构，使用在线软件SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)分析FAS蛋白三级结构。
1.4.6FAS基因在贵州黑山羊各组织中的表达运用qRT-PCR检测FAS基因在贵州黑山羊各组织中的表达量。qRT-PCR体系20 μL：Sso Fast Eva Green Super mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA模板(200 μg/ μL)0.5 μL，ddH2O 8.7 μL。
qRT-PCR反应条件：95 ℃预变性2 min；
95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。每个样品设3个重复。
1.4.7 数据分析运用2-ΔΔCt方法分析各组织FAS基因的表达量数据，运用软件SPSS 18.0单因素方差分析差异显著性。
2.1 贵州黑山羊FAS基因的克隆与鉴定以贵州黑山羊脂肪组织RNA反转录产物为模板，PCR扩增得到981 bp左右的条带(见图1)，与预期相符。阳性克隆测序结果与GenBank中山羊FAS基因CDS区序列一致。
M：DL 10 000 DNA Marker；
1：阳性克隆图1 贵州黑山羊FAS基因阳性克隆PCR鉴定
2.2 贵州黑山羊FAS基因的同源性分析将克隆的贵州黑山羊FAS基因CDS区序列与GenBank中的绵羊(NM_001123003.1)、人(NM_000043.6)、恒河猴(XM_015147623.2)、黑猩猩(XM_016918828.2)、大熊猫(XM_034662402.1)、马(XM_023643111.1)、普通牛(NM_174662.2)、鸡(NM_001199487.2)、狗(XM_038437712.1)、猪 (NM_213839.1)、野牦牛(XM_005897713.1)的FAS基因核苷酸序列进行同源性比对，结果显示：贵州黑山羊FAS基因与绵羊的同源性最高(97.3%)，与鸡的同源性最低(49.0%)(见图2)。系统进化树分析结果显示：贵州黑山羊FAS基因与绵羊位于同一分支，遗传距离最近，与普通牛和野牦牛也具有较近的亲缘关系，与鸡处于不同分支，遗传距离最远(见图3)。
图2 贵州黑山羊FAS基因的同源性分析
图3 贵州黑山羊FAS基因的遗传进化树分析
2.3 贵州黑山羊FAS蛋白的理化性质分析贵州黑山羊FAS基因CDS区全长981 bp，共编码326个氨基酸，分子式为C2958H4937N981O1221S195，分子量为36 774.02，理论等电点值为7.96；
所含氨基酸种类较多，含量较高的有亮氨酸(9.2%)、谷氨酸(8.9%)、赖氨酸(8.3%)、天门冬氨酸(8.3%)、丝氨酸(7.7%)和半胱氨酸(7.1%)。
2.4 贵州黑山羊FAS蛋白二级和三级结构分析贵州黑山羊FAS蛋白的二级结构预测显示：FAS蛋白中α螺旋为34.66%，延伸链为6.75%，无规则卷曲为55.21%，β转角为3.37%。FAS蛋白三级结构预测分析显示：主要结构有α螺旋和无规则卷曲，与预测的二级结构相一致(见图4)。
图4 贵州黑山羊FAS蛋白三级结构预测构象图
2.5FAS基因在贵州黑山羊各组织中的表达分析FAS基因在贵州黑山羊各组织中均有表达，在脂肪组织中表达量最高，各组织中表达量依次为脂肪>背最长肌>肺>大肠>脾>肾>腿肌>心>小肠>肝(见图5)。
图5 贵州黑山羊各组织中的FAS基因表达注：图中不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)
贵州黑山羊FAS基因CDS区全长981 bp，与绵羊的亲缘关系最近；
蛋白质二、三级结构主要由无规则卷曲和α螺旋组成；
FAS基因在贵州黑山羊脂肪组织中表达量最高，表明对贵州黑山羊脂肪形成具有重要调控作用。
4.1在动物体内，FAS的乙酰/丙二酸单酰基转移酶(Acetyl-CoA and malonyl-CoA transacylases，AT/MT)基因功能域主要负责底物的转运，能将带有支链的底物合成支链脂肪酸，AT/MT转移酶的转运能力决定动物组织中脂肪的含量[6]，因此FAS基因在控制动物体脂沉积过程中发挥重要作用。研究发现，FAS基因的表达水平与动物体内的甘油三酯呈正相关，与动物肥胖有关，是影响畜禽脂肪形成的关键候选基因[7]。
4.2相关研究表明，FAS基因在物种间的保守性较低[8]。本研究发现，贵州黑山羊FAS基因CDS区序列与GenBank中山羊的序列进行对比未发现突变。通过对贵州黑山羊FAS基因的同源比对和系统进化树分析显示，除与绵羊(97.3%)、牦牛(94.2%)同源性较高外，与其他物种的同源性均较低，这与杨莉等[9]的研究结果一致。对贵州黑山羊FAS蛋白分析发现，FAS共有326个氨基酸，二、三级结构主要由无规则卷曲和α螺旋组成，这与陈学生等[10]的研究结果一致。
4.3本研究结果发现，FAS基因在贵州黑山羊脂肪中的表达量最高，在肺、大肠、背最长肌中也有较高表达，这与姚焰础[11]的研究结果一致。相关研究发现，FAS基因在哈萨克绵羊出生当天脂肪组织中的表达量最高，之后随着年龄增长开始下降[12]。但对苏尼特羊的研究结果则不同，随着羔羊年龄和体重增加，肌肉和肝脏组织中FAS基因的表达量先下降后升高，整体呈上升趋势[13]。目前关于FAS基因在贵州黑山羊不同生长发育期各组织中的表达变化还不清楚，尚需进一步研究。
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