陈柏安，刘东超,2，王思盼
(1.广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088；
2.广东省藻类养殖及应用工程技术中心，广东 湛江 524025)
大型海藻具有效吸收水产养殖废水中大量氮、磷等营养盐的功能，学界将其作为生物滤器开展了养殖水环境的生物修复研究，取得较好效果[1]。不同种类的大型海藻对水中溶解氮的生物过滤效果不同[2]。海藻对氮源的吸收还受环境参数(光、盐度、温度、干燥和水运动)，海藻生物学特性、组织营养史、营养物质浓度及化学形态等因素的影响[3-5]。盐度是影响藻类生长和分布的重要环境因子之一[6-7]，但仅见少量有关盐度对大型海藻吸收氮营养盐影响的研究，未见关于不同盐度条件下大型海藻氮营养盐吸收动力学的报道。
长茎葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）是一种生长速度快、经济价值高的可食用大型绿藻，其生存盐度为20～50，在盐度35 时生长速率最大，盐度低于25 时光合作用受抑制[6]，盐度对其生长发育有显著影响[8]。在适宜NH4-N、NO3-N 比例的条件下，长茎葡萄蕨藻对NO3-N 有显著的吸收和同化能力，有望有效控制水体硝酸氮浓度并将硝酸氮转移到生物体中[9]。长茎葡萄蕨藻与鱼虾混养，对养殖水环境有显著改善作用[10,11]。但该藻的氮营养生理学过程尚不明确，尤其是在不同盐度和高浓度氮营养盐条件下，该藻对不同化学形态氮盐的吸收规律研究尚少。本研究分析在不同盐度下长茎葡萄蕨藻对氨氮和硝态氮的吸收动力学特征，为构建以长茎葡萄蕨藻为生物滤器的水产养殖系统提供理论依据。
1.1 材料
长茎葡萄蕨藻于2021 年4 月购自广东省深圳市蓝汀鼎执生物有限公司，藻体用消毒海水冲洗，清除藻体上的附生生物及杂物，于室内盛有消毒海水的塑料箱中暂养7 d，培养条件为温度（22±1）℃，照度（2 000±100）lx，光/暗周期12 h L/12 h D，营养盐为0.5 mmol/L 的NaNO3溶液和0.1 mmol/L 的KH2PO4溶液，海水盐度30±1。实验前，选择健壮、完整的长茎葡萄蕨藻藻体，仔细去除表面附着物后进行48 h的氮饥饿处理[12]。实验用海水取自湛江霞山近岸海域，其本底氨氮质量浓度为0.04 mg/L，硝酸氮质量浓度为0.03 mg/L，活性磷质量浓度为0.02 mg/L，pH为8.06。海水经滤袋过滤、消毒后，使用海藻吸收水体营养盐12 h，储存在水桶中备用。
1.2 实验设计
实验容器为2 L 的塑料桶，每桶加入2 L 实验海水，各放入（10±1）g的处于N 饥饿状态的新鲜长茎葡萄蕨藻。根据王海阳等研究[13]及本研究预实验结果，长茎葡萄蕨藻在盐度高于35 或低于25 时生长受抑制并出现部分藻体软化现象，因此设置25、30和35 等3 个盐度梯度，进行NH4+-N 和NO3–-N 吸收实验。实验海水的盐度为30，用蒸馏水或自然海盐调节盐度。将单一氮源的NH4+-N（NH4Cl）或NO3–-N（NaNO3）分别添加入实验海水中。根据预实验结果，NH4+-N 和NO3–-N 均按终末质量浓度设置0、2、4、6、8、10、12 mg/L 等7 个梯度，每个梯度设置3 个重复。实验海水中加入KH2PO4作为磷源，海水磷浓度达到4 mg/L，使海藻不会因缺磷而影响氮吸收[14]。各处理组均在光照培藻架上培养，照度为3 000 lx，温度为（22±1）℃。根据预实验结果，在0、1、2、3 h时测定海水氮营养盐含量，用海水中的氮营养盐下降量换算出氮营养盐的吸收速率。实验用药品均为国产分析纯。
1.3 数据分析
长茎葡萄蕨藻吸收氮盐速率(v)计算：
式中，Nt为培养th时水体的营养盐浓度，V为取样前水体的体积，m为实验开始时藻体的鲜质量。
NH4-N 使用SmartChem 200 全自动间断化学分析仪测定，NO3-N用锌镉还原-重氮偶氮法测定[15]。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，采用Graphpad Prism 7进行非线性回归拟合并作图，最大吸收速率（vmax）和米氏常数（Km）用米氏动力学方程拟合求得。使用如下公式计算米氏动力学方程[16]：
式中，v为吸收速率（μg·g-1·h-1），vmax为最大吸收速率（μg·g-1·h-1），ρs为介质中营养盐质量浓度（μg/L），Km为半饱和常数（μg/L）。
用软件SPSS 24 分析相同营养盐形式下长茎葡萄蕨藻在不同盐度下吸收动力学参数的差异以及相同营养盐浓度下藻株不同氮源吸收速率的差异，若差异显著则进行Duncan’s多重比较。显著水平α=0.05。
2.1 盐度对长茎葡萄蕨藻硝态氮吸收的影响
图1显示，不同时间段的吸收曲线略有差异，但总的变化趋势相似。在不同盐度下，长茎葡萄蕨藻对NO3–-N 的吸收速率均随培养介质中硝态氮浓度的增加总体上呈增加趋势。表1 可见，随着时间的增加，硝酸氮最大吸收速率（vmax）总体上呈下降趋势，盐度25、35 时，1 h 的硝酸氮最大吸收速率（vmax)显著高于2、3 h（P<0.05），盐度30 组1、2、3 h 的vmax分 别 为 (179.8±17.4)、(141.10±13.82)、(150.7±24.1)μg/(g·h)，平均值分别高于其他盐度组，但差异不显著（P>0.05）。在相同时段，盐度对长茎葡萄蕨藻硝态氮吸收速率的影响不显著（P>0.05）。长茎葡萄蕨藻在1 h 时，硝态氮浓度在4 mg/L 时吸收速率便趋于平缓，而在3 h 时，硝态氮浓度达到6～8 mg/L时，吸收速率才趋于平缓。
图1 不同盐度下长茎葡萄蕨藻硝态氮的吸收曲线Fig.1 Absorption curve for nitrate nitrogen in Caulerpa lentillifera at different salinities
2.2 盐度对长茎葡萄蕨藻氨氮吸收的影响
图2 显示，在不同盐度下，长茎葡萄蕨藻对NH4+-N 的吸收速率均随培养介质中氨氮浓度的增加总体上呈上升趋势。表1可见，在低盐度下，长茎葡萄蕨藻对氨氮最大吸收速率较高，盐度25 时，vmax为(435.2±57.2) μg/(g·h)，显著高于盐度35 时（P<0.05）。在高氮浓度下（12 mg/L），低盐度组氨氮吸收速率相对于盐度35 组有增加趋势，培养1、2 h 时显著高于盐度35组（P<0.05）（图2）。在各盐度组，1 h的氨氮最大吸收速率显著高于3 h（P<0.05），2 h时，盐度25与盐度30最大吸收速率无显著差异（P>0.05），盐度35 组显著低于其他两组（P<0.05）。在3 h时，各盐度组长茎葡萄蕨藻的最大氨氮速率无显著差异（P>0.05）。
表1 长茎葡萄蕨藻不同盐度的氮盐吸收动力学参数比较Table 1 Nitrogen uptake kinetics parameters of Caulerpa lentillifera at different salinities
图2 不同盐度下长茎葡萄蕨藻氨氮的吸收曲线Fig.2 Absorption curve for ammonia nitrogen in Caulerpa lentillifera at different salinities
2.3 不同盐度下长茎葡萄蕨藻对硝酸氮和氨氮吸收动力学参数的比较
3 种盐度下长茎葡萄蕨藻对NH4+-N 和NO3–-N的vmax和Km见表1。1 h 时，长茎葡萄蕨藻对氨氮与硝酸氮的vmax均呈现低盐度>高盐度趋势，但大多数组别差异不明显，仅在氨氮的vmax上低盐度（25、30）显著高于高盐度组（35）。长茎葡萄蕨藻对硝酸氮吸收的半饱和常数总体上大于氨氮的半饱和常数，且在不同盐度下，硝酸氮在不同时段的Km差异较大（P<0.05），而吸收时间和盐度对长茎葡萄蕨藻氨氮吸收的半饱和常数无显著影响（P>0.05）。
3.1 盐度对大型海藻吸收氮盐的影响
盐度影响植物细胞内外的渗透压，进而影响细胞水分及对N、P 的吸收。不同大型海藻中，盐度对其吸收氮营养盐的影响不尽相同。在冷水性海带（Saccharina latissima）和掌状海带（Laminaria digi‐tata）对NO3–-N 吸收研究中，低盐度（18）比高盐度（34）分别增加47%和33%[17]。天然海水盐度降低到一半时，齿缘墨角藻（Fucus serratus）对NO3–-N 的吸收增加40%，而墨角藻（Fucus vesiculosus）和掌状海带（L.digitata）则无显著影响[18]。细基江蓠繁枝变种（Gracilaria tenuistipitatavar.liui）在较低盐度下(10～30)对NH4+-N 的吸收速率大于高盐度(40)[19]。本研究表明，在较高氮质量浓度（12 mg/L）条件下，长茎葡萄蕨藻对NH4+-N 的吸收速率呈现为低盐度（25）高于高盐度（35），而盐度对硝酸氮的吸收速率无显著影响。在实际应用中，长茎葡萄蕨藻生长海域盐度多为35，本研究中该藻吸收氮盐的最适盐度略低于最适生长盐度，这可能是因为在低盐度条件下，藻体可快速吸收营养物质，用于生长和短期的渗透压调节。Roleda 等[4]提出海水中高营养物浓度和低盐度的交互作用可弥补低盐度任何独立负面影响的假设，本研究结果可为该假设提供一定佐证。
在实际生产中，养殖户多利用原位海域养殖长茎葡萄蕨藻，陆基水体养殖一般采用室内工厂化水池（箱）的养殖方式[20]。实际应用时，可根据海水盐度条件，单养长茎葡萄蕨藻或与适宜的水产养殖动物混养。本研究虽有盐度25 下氨氮吸收速率较高的结论，但在盐度30 的条件下，长茎葡萄蕨藻对氮盐亦有较高的营养盐吸收性能，因此，本研究结果可为长茎葡萄蕨藻原位海域养殖或陆基池塘养殖提供参考。
在盐度31 条件下，针叶蕨藻（Caulerpa sertular‐ioides）氨氮最大吸收速率为4.15 μmoL/(g·h)[21]，而本研究中长茎葡萄蕨藻的氨氮最大吸收速率可达(31.09±4.11)μmol/(g·h)[435 μg/(g·h)]，表明相近盐度下蕨藻属不同物种对氨氮吸收能力存在差异。
3.2 长茎葡萄蕨藻对氮盐的吸收动力学特征
营养吸收动力学是一种推断吸收机制的有效方法，可确定海藻的营养盐吸收速率与营养盐浓度的关系[4]，以此评估海藻在综合养殖系统中的应用潜力。营养吸收动力学研究聚焦于营养盐吸收过程中的吸收机制，若仅仅为被动扩散，吸收速率直接与电化学势梯度(即外界营养盐浓度) 呈线性关系，而易化扩散和主动传递则随外界营养盐浓度的增加表现出膜载体的饱和现象[22]。
海藻对NO3–-N 的吸收是需能的主动运输过程，在植物代谢过程中受基因高度调控[23]。邵魁双等[24]报道，缘管浒苔（Enteromorpha linza）和羽藻（Bryopsis plumosa）对NO3–-N 的吸收方式为主动运输。长茎葡萄蕨藻对NO3–-N 有较强的亲和力[9]。本研究表明，不同盐度下，长茎葡萄蕨藻对NO3–-N的吸收速率随硝酸氮浓度的升高而升高，当硝酸盐达到一定浓度，吸收速率趋于稳定，符合主动运输的饱和吸收动力学规律。这与一般大型海藻对硝酸氮的吸收为饱和吸收动力学特征的结论一致。
海藻对NH4+-N 的吸收速率随时间和物种的不同而不同。海藻对氨氮的转运包含两个独立的转运系统，即氨氮在浓度低时通过被动扩散进入藻体细胞，以及通过藻体细胞上跨膜运输蛋白主动运输进入藻细胞[25]。自然海水中氨氮浓度较低，海藻对NH4+-N 的吸收主要为主动运输，但更多是主动运输与被动运输的结合[26]。部分大型海藻对氨氮的吸收速率随着氨氮浓度和吸收表面积的增大呈线性增长，这表明部分海藻对氨氮的吸收属于被动吸收[27]。对于大型海藻对氨氮的吸收是否遵循饱和吸收动力学，可能与海藻生长的地理位置、生理代谢活动和种间差异有关[28]。Taylor 等[27]研究发现，新西兰东北部的5 种海藻中，仅鸡毛菜（Pterocladia capillacea）对氨氮吸收表现出饱和吸收动力学特征，Xiphophora chondrophylla、石莼（Ulvasp.)、紫菜(Porphyrasp.) 和浒苔（Enteronlorphasp.）的氨氮吸收速率与氨氮浓度则呈线性关系，而其他地区的Neoagardhiella baileyi、Gracilaria foliifera等海藻对NH4+-N 吸收表现出饱和吸收动力学的特征。本研究表明，长茎葡萄蕨藻对NH4+-N 吸收表现出饱和吸收动力学特征，这可能是因为长茎葡萄蕨藻分枝上有较多囊状小球，比表面积较高，使长茎葡萄蕨藻在低氨氮浓度下也能通过主动运输而较快吸收氨氮，而当胞内氨水平较高时，同化的氨会对摄取行为产生负反馈[29]。针叶蕨藻（Caulerpa sertulari‐oides）对NH4+-N 吸收亦表现出饱和吸收动力学特征[29]，与本研究结果一致，可能与两者分布的地理位置相同有关。
3.3 不同盐度下长茎葡萄蕨藻对两种形式氮盐的吸收利用
一般地，海藻主要利用硝态氮(NO3–-N)、氨氮(NH4+-N)和尿素等3种形式的氮。硝酸氮和氨氮是大型海藻最主要的氮源，氨氮比硝酸氮和亚硝酸氮更易吸收[30]。了解海藻对特定营养物的吸收模式和偏好是优化综合水产养殖系统结构的关键。研究表明，与NO3–-N 相比，许多海藻更优先吸收NH4+-N[23]，然而，也有部分海藻在自然环境中优先吸收其他形态的氮源。Li 等[31]研究发现，中国黄海浒苔（Ulva prolifera）优先利用海水中的硝酸氮，其次是氨氮。海藻对氨氮与硝态氮的偏好可能与营养盐在海藻中的传递和同化方式有关。本研究表明，长茎葡萄蕨藻对氨氮的最大吸收速率和半饱和常数皆优于硝态氮，说明长茎葡萄蕨藻会优先吸收氨氮作为氮源，这与大多数海藻相似[32]，但也有研究表明长茎葡萄蕨藻在NH4+-N 与NO3–-N 共存时，更倾向于优先选择NO3–-N[9]，这可能与海藻的生长状态和环境因子密切相关。硝酸氮的吸收和同化过程的耗能高于氨氮，氨氮进入藻细胞后可直接被同化，而硝酸氮进入后还需进行一系列的耗能还原反应方被利用[33]。进一步了解氨氮和硝酸氮在海藻中的吸收规律，对估计海藻氮吸收和提高海藻生产力有着重要意义。
长茎葡萄蕨藻在不同盐度下对硝态氮和氨氮的吸收符合饱和吸收动力学特征，其对氨氮、硝态氮的吸收速率随着浓度的上升而逐步上升。长茎葡萄蕨藻对氨氮的最大吸收速率显著高于硝态氮的最大吸收速率，是硝态氮的2.4 倍。不同盐度（25～35）对长茎葡萄蕨藻硝态氮吸收无显著影响，但对氨氮的吸收有显著影响，在较低盐度（25）下，氨氮的吸收速率较高。本研究明确长茎葡萄蕨藻对硝态氮和氨氮在不同盐度下的吸收规律，可为长茎葡萄蕨藻作为水产养殖生物滤器，选择适宜混养水产养殖动物，构建陆基综合水产养殖系统提供理论依据。
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