陈秋森，陈凤琼，刘汉林，褚霈宇，王华美，任春元，赵强，曹亮，于高波，张玉先
（黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆,163319）
菜用大豆又称毛豆，是豆科大豆属的栽培大豆种，属于特用大豆[1,2]。作为世界上最大的菜用大豆生产国和出口国，中国的菜用大豆栽培面积不断增加，其病虫害也频繁发生，严重影响了我国菜用大豆的产量和品质[3,4]。目前防治病虫害的有效方式仍以施用农药为主。然而，由于菜用大豆是采收鲜荚，直接剥粒食用，农药的不当使用会给人们的身体健康带来巨大的隐患，同时对生态环境也有不利影响[5]，各国对菜用大豆农药残留也都有严格要求[6]。因此，减少菜用大豆的农药残留已成为保障菜用大豆产品质量和食用安全的基本要求，同时也是提高菜用大豆出口合格率的重要措施。
多菌灵和百菌清是常见的杀菌剂，可有效防治菜用大豆灰斑病、荚枯病、根腐病等真菌性病害的发生，广泛应用于菜用大豆的生产[7]，然而过量或不合理使用多菌灵和百菌清极易造成菜用大豆的农药残留问题。因此，降低菜用大豆中多菌灵和百菌清残留在大豆生产中具有重要的科学和现实意义。
褪黑素是一种广泛存在于动植物体内的多效性分子[8]，在干旱、低温、盐碱等非生物胁迫中均具有积极的调控作用[9]。近年来，相关研究发现，褪黑素在降解植物农药残留中也具有重要作用。陈媛媛等[10]研究发现褪黑素能够缓解甜瓜幼苗三唑酮毒害的生理效应。而Wei 等[11]研究也表明，褪黑素处理还可以提高苹果对百草枯的耐受性。此外，近年来表达褪黑素合成相关基因被认为可提高植物抗逆性，在拟南芥、水稻、番茄等植物中均已得到验证[12～14]。但是关于褪黑素对菜用大豆残留杀菌剂的降解是否具有调控效应鲜有报道。因此，本研究以菜用大豆为材料，以多菌灵和百菌清为杀菌剂，探究外源褪黑素处理对菜用大豆残留杀菌剂降解的调控效应，以期为后续大豆农药残留降解的研究和促进残留农药代谢试剂的开发应用提供必要的理论基础。
1.1 材料与试剂
菜用大豆品种浙鲜12，由国家杂粮工程技术研究中心提供；
褪黑素（C13H16N2O2），购自Sigma Aldrich公司。
1.2 试验处理
试验于黑龙江八一农垦大学生物技术中心人工气候室进行，盆栽，基质为草炭土和蛭石（3∶1），播种前选取色泽均匀、颗粒饱满、大小一致的种子，用5%的次氯酸钠消毒，于2020 年5 月6 日进行播种，播种后常规管理。待菜用大豆生长至R3 期（初荚期，2020年7月3日）进行处理与取样。
将植株随机分为4组：①百菌清处理：使用蒸馏水连续喷施3 d，第4 d喷施有效浓度为11.2 mmol/L的百菌清；
②百菌清+褪黑素处理：100µmol/L 褪黑素进行叶面喷施，连续处理3 d，第4 d喷施有效浓度为11.2 mmol/L 的百菌清；
③多菌灵处理：使用蒸馏水连续喷施3 d，第4 d喷施有效浓度为13.1 mmol/L的多菌灵；
④多菌灵+褪黑素处理：100µmol/L 的褪黑素进行叶面喷施，连续处理3 d，第4 d喷施有效浓度为13.1 mmol/L 的多菌灵溶液。于杀菌剂处理24 h 后取样，部分保存于-20℃，用于生理生化指标的测定，部分保存于-80℃，用于基因表达量的测定。农药处理7 d 后取样，-20℃保存用于测定农药残留量。
1.3 测定项目与方法
1.3.1 农药残留量 参照任晓萍等[15]的方法测定菜用大豆叶片中百菌清残留量，参照郝露露等[16]的方法测定菜用大豆叶片中多菌灵残留量。
1.3.2 氧化损伤指标 采用硫代巴比妥酸法[17]测定菜用大豆叶片中丙二醛（MDA）含量，参考刘俊等[18]的方法测定菜用大豆叶片中过氧化氢（H2O2）含量。
1.3.3 抗氧化系统 采用比色法[19]测定菜用大豆叶片中的抗坏血酸（AsA）含量，参考Ma 等[20]的方法测定菜用大豆叶片中的还原型谷胱甘肽（GSH）含量，采用氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性，采用紫外吸收法测定过氧化氢酶（CAT）活性和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性[21]。1.3.4 解毒系统 参考Sharma 等[22]的方法测定菜用大豆叶片中的非蛋白结合态巯基（NPT）含量，采用试剂盒方法测定（购自睿信生物科技有限公司）ABC 转运蛋白活性。采用实时荧光定量PCR 测定菜用大豆叶片中解毒相关基因（P450、GST22和ABC-C3）表达量[23]。
1.4 数据处理
所得数据用Microsoft Excel 2010 进行数据分析，并采用利用SPSS 21.0 软件对各处理间显著性进行分析，最终利用Origin 2019软件绘制图表。
2.1 外源褪黑素处理对菜用大豆体内农药残留量的影响
如图1A 所示，经褪黑素预处理后，菜用大豆叶片中多菌灵和百菌清残留量均显著降低。其中百菌清残留量为单独农药处理的56%，多菌灵残留量为单独农药处理的84%。非蛋白结合态巯基（NPT）主要包括谷胱甘肽及其共轭物和代谢产物。如图1B 所示，与单独多菌灵和百菌清处理相比，外源褪黑素预处理后菜用大豆叶片中NPT 含量均显著上升，说明外源褪黑素处理有效地促进菜用大豆中NPT的形成，增强多菌灵和百菌清的降解代谢，减少菜用大豆体内的农药残留含量。
图1 外源褪黑素处理后菜用大豆叶片中农药残留量（A）和NPT含量（B）Fig.1 Pesticide residue（A）and NPT content（B）under exogenous melatonin treatment on vegetable soybean leaves
2.2 外源褪黑素处理对菜用大豆体内GSH-AsA途径的影响
外源褪黑素处理影响菜用大豆叶片中GSH 和AsA的含量（图2）。在多菌灵和百菌清处理下，外源褪黑素预处理可显著提高菜用大豆中GSH（图2A）和AsA（图2B）含量。其中，与单独百菌清处理相比，褪黑素预处理后菜用大豆中GSH和AsA含量分别上升24.1%和72.5%；
与单独多菌灵处理相比，褪黑素预处理后菜用大豆中GSH和AsA含量分别上升40.5%和34.7%。由此可见，外源褪黑素处理可以通过提高GSH和AsA含量促进GSH-AsA循环，进而促进菜用大豆中残留多菌灵和百菌清的降解。
图2 外源褪黑素处理后菜用大豆叶片中GSH（A）和AsA含量（B）Fig.2 GSH（A）and AsA content（B）under exogenous melatonin treatment on vegetable soybean leaves
2.3 外源褪黑素处理对菜用大豆体内抗氧化酶活性的影响
外源褪黑素预处理可显著提高菜用大豆叶片中抗氧化酶活性（图3）。与单独百菌清处理相比，褪黑素预处理后菜用大豆叶片中SOD 活性（图3A）和CAT 活性（图3C）均显著上升，且分别上升14.5%和25.4%，而菜用大豆中POD 活性却有所下降（图3B），APX活性则无显著性差异（图3D）；
与单独多菌灵处理相比，预处理褪黑素后菜用大豆中SOD、POD、CAT 和APX 活性均显著上升，其中SOD 活性提高最为显著，比单独多菌灵处理提高了4.5倍（图3A），其次为POD 活性，比单独多菌灵处理提高了102.2%（图3B），而CAT 活性和APX 活性则分别提高了92.3%和38.7%（图3C、D）。由此可见，外源喷施褪黑素可显著增强菜用大豆中抗氧化酶活性，促进活性氧的清除，进而缓解农药处理造成的细胞损伤，降低菜用大豆体内的农药残留。
图3 外源褪黑素处理下菜用大豆叶片中抗氧化酶活性Fig.3 Antioxidant enzyme activitiesunder exogenous melatonin treatment onvegetable soybean leaves
2.4 外源褪黑素处理对菜用大豆体内MDA 和H2O2含量的影响
外源褪黑素预处理对菜用大豆叶片中MDA 和H2O2含量的影响如图4所示。在多菌灵和百菌清处理下，通过外源褪黑素预处理可显著降低菜用大豆中MDA 含量（图4A）。与单独百菌清和多菌灵处理相比，预处理褪黑素可使菜用大豆中MDA含量分别降低了8.5%和8.9%。可见外源褪黑素处理可以通过降低菜用大豆中MDA含量，从而抑制细胞膜脂过氧化程度的增加，缓解农药胁迫下菜用大豆细胞受到的损伤。此外，外源褪黑素预处理后，大豆体内H2O2含量也显著性降低（图4B），与单独百菌清处理相比，外源褪黑素预处理使菜用大豆体内H2O2含量降低13.6%，与单独多菌灵处理相比，预处理褪黑素使菜用大豆体内H2O2含量降低8.0%。这说明外源褪黑素处理可通过直接清除菜用大豆体内活性氧来缓解农药对植株造成的氧化损伤，进而促进大豆体内残留农药的降解代谢。
图4 外源褪黑素处理后菜用大豆叶片中MDA（A）和H2O2（B）含量Fig.4 MDA（A）and H2O2（B）contents under exogenous melatonin treatment on vegetable soybean leaves
2.5 外源褪黑素处理对菜用大豆体内解毒系统的影响
细胞色素P450、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和ABC 转运蛋白是植物体内重要的解毒酶，可以有效缓解农药处理对植物造成的损伤。外源褪黑素预处理影响菜用大豆体内解毒系统（图5）。经外源褪黑素预处理后，菜用大豆叶片中解毒基因表达量显著上升。与单独百菌清处理相比，预处理褪黑素后菜用大豆叶片中P450和GST22的相关基因表达量显著上调，其中P450相关基因表达量为单独百菌清处理的14.5倍（图5A），GST22相关基因表达量为单独百菌清处理的1.3 倍（图5B）。而ABC-C3相关基因表达量经褪黑素预处理后反而低于单独百菌清处理（图5C），为此我们测定了菜用大豆叶片中ABC转运蛋白活性进行验证（图5D），其结果与相关基因表达量变化趋势一致。与单独多菌灵处理相比，外源褪黑素预处理后菜用大豆叶片中P450、GST22和ABC-C3相关基因表达量均显著上调，且分别比单独多菌灵处理上调了182.2%、141.9%和413.4%（图5A、B、C），此外，经褪黑素预处理后ABC 转运蛋白活性也比单独多菌灵处理提高了36.2%（图5D）。由此可见，外源褪黑素处理可调控菜用大豆中解毒基因的表达，进而提高解毒酶活性，促进菜用大豆体内多菌灵和百菌清的代谢，从而降解菜用大豆中的农药残留。
图5 外源褪黑素处理后菜用大豆解毒系统相关基因的表达量Fig.5 Expression of genes related to detoxification system of vegetable soybean treated with exogenous melatonin
对于植物来说，农药是一种异源物质，高剂量的农药导致植物体内活性氧（ROS）的过量产生，这些活性氧具有高度的活性和毒性，最终导致氧化应激，对细胞产生毒性作用[24]。Kanwar等[25]研究发现，外源褪黑素处理使番茄中的活性氧含量显著降低，提高了作物对双酚A 的解毒作用。在本研究中，预处理外源褪黑素降低了杀菌剂处理下菜用大豆中H2O2的含量，从而缓解了杀菌剂对菜用大豆造成的细胞毒性。可见外源褪黑素处理可通过直接清除菜用大豆体内的活性氧，从而有效缓解农药处理对菜用大豆造成的氧化损伤，提高菜用大豆对农药的耐受性。同时，在外源褪黑素处理下，菜用大豆中MDA 含量也显著降低，说明外源褪黑素可有效抑制菜用大豆的膜脂过氧化，降低农药处理对菜用大豆造成的细胞损伤。
植物细胞及其细胞器如叶绿体、线粒体和过氧化物酶体等通过抗氧化防御系统保护自身免受活性氧的伤害。植物的抗氧化防御系统包括非酶抗氧化剂和抗氧化酶[26]。AsA-GSH 循环是非酶抗氧化剂防御的主要途径，它们不仅可以直接清除一定范围的ROS，而且在细胞质和其他细胞器中维持氧化还原状态，从而增强抗氧化能力，并减少由不同的非生物胁迫引起的氧化应激[27]。Fatma 等[28]研究发现，芥菜中AsA、GSH 含量提高可通过清除活性氧缓解盐胁迫带来的伤害；
Xia 等[29]研究发现，外源褪黑素处理可以诱导干旱胁迫下猕猴桃中的AsAGSH 循环。在本研究中，多菌灵和百菌清处理下，外源褪黑素处理可以显著提高菜用大豆中GSH 和AsA 含量，说明外源褪黑素处理可以通过调节AsA-GSH 循环清除菜用大豆体内活性氧，从而减少菜用大豆在农药处理下受到的伤害，降低农药残留量。
逆境胁迫下，植物体内的抗氧化酶活性显著增强，SOD、POD、CAT 和APX 是植物酶促防御系统的四种重要抗氧化酶，能有效分解活性氧自由基，从而减少植物在逆境胁迫中受到的伤害[30]。Li 等[31]研究表明，外源褪黑素处理可以提高盐胁迫下西瓜体内的抗氧化酶活性；
张明聪等[32]研究发现，外源褪黑素处理可以提高干旱胁迫下大豆体内的抗氧化酶活性。在本研究中，外源褪黑素处理显著提高了多菌灵处理下菜用大豆中4 种抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）的活性，并且显著提高了百菌清处理下菜用大豆中SOD 和CAT 的活性，从而促进了活性氧的清除，缓解了菜用大豆在多菌灵和百菌清处理中受到的伤害，促进了残留百菌清和多菌灵的降解。
褪黑素作为一种多效性分子，在植物体内广泛存在，可有效缓解植物面临的多种非生物胁迫[33]。近年来，褪黑素在降解植物农药残留中的作用引起了科研人员的广泛研究。Ding 等[34]研究发现，外源褪黑素处理可以有效提高杨树对甲基紫精的耐受性，而Liu 等[35]研究也发现，外源褪黑素处理可有效降低黄瓜中吡虫啉的残留量。此外，前人研究发现，当植物遭受农药胁迫时，激活自身解毒机制以缓解胁迫带来的损伤[36]。植物的解毒过程可分为三个阶段。第一阶段是由细胞色素P450 催化的酶促反应及非酶过程；
第二阶段主要是谷胱甘肽-S-转移酶（GST）与糖基转移酶等的轭合反应；
在第三阶段，代谢产物在ABC 转运蛋白的调控下被进一步转运到细胞质外[37,38]。Yuan 等[39]研究发现细胞色素P450 是生物体内的重要代谢酶，能够降解大多数外源有毒物质；
而李冬琴等[40]研究证明，水稻中GST活性提高有利于缓解镉胁迫带来的伤害；
此外，也有研究发现，ABC 转运蛋白可以提高植物对草甘膦的抗性[41]。本试验中，在百菌清处理下，外源褪黑素预处理可以显著提高菜用大豆中P450、GST的相关基因表达量，但菜用大豆中ABC 转运蛋白相关基因表达量经褪黑素预处理后反而有所降低，因此，我们对ABC 转运蛋白酶活性进行了验证，结果与ABC 相关基因表达量趋势一致。而在多菌灵处理下，经外源褪黑素预处理后菜用大豆中P450、GST、ABC的相关基因表达量均显著提高。这说明百菌清处理下，外源褪黑素处理可以通过诱导一相和二相解毒相关基因的表达以促进菜用大豆中残留百菌清的降解；
而在多菌灵处理下，外源褪黑素处理则可以通过诱导菜用大豆解毒过程三个阶段的相关基因表达以促进其残留多菌灵的降解。本研究还发现，通过外源褪黑素处理，菜用大豆中NPT 含量显著上升，促进了菜用大豆体内杀菌剂的降解，有效降低了菜用大豆中多菌灵和百菌清的残留量。这一结果与Liu 等研究发现的外源褪黑素可有效降低黄瓜中吡虫啉残留量的结果一致。
外源褪黑素处理可以直接清除菜用大豆体内的活性氧，缓解杀菌剂处理对菜用大豆的细胞损伤，也可以通过提高菜用大豆中GSH-AsA含量和抗氧化酶活性，从而促进活性氧的清除，增强菜用大豆中残留百菌清和多菌灵的代谢。与此同时，在多菌灵和百菌清处理下，外源褪黑素预处理还可以通过诱导解毒相关基因的表达，提高解毒酶活性，促进菜用大豆中残留多菌灵和百菌清的降解代谢。综上所述，外源褪黑素处理可以有效缓解杀菌剂处理对菜用大豆受到的细胞损伤，促进菜用大豆对残留杀菌剂的解毒作用，从而降低菜用大豆中多菌灵和百菌清的残留量。
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