李元超 王刚,2 王磊 吴玮,2
1 战略支援部队特色医学中心耳鼻喉科(北京 100101)；
2 国家环境保护环境感官应激与健康重点实验室
耳蜗内毛细胞带状突触(ribbon synapse，RS)是内毛细胞(inner hair cell，IHC)与Ⅰ型螺旋神经元(spiral ganglion neurons，SGNs)形成的突触，作为听觉传入通路中的第一个突触，负责完成声信号的机械-电换能过程[1]，是听觉通路的重要组成部分。在噪声暴露[2]、老龄化[3]、使用耳毒性药物[4]等情况下，RS会发生病理性改变引发听觉障碍。遗传因素在耳聋发生中的作用更加重要，每1 000个新生儿中就有一个患先天性聋，其中60%以上是由遗传因素导致[5]。遗传物质改变造成RS缺陷致聋的情况被称为听突触病(auditory synaptopathy)[6，7]，属于听神经病的一种，致病基因可干扰突触小泡装载、递质释放，影响突触前膜离子通道和突触后膜受体的正常功能，并致其他结构损伤。针对这类致病基因的研究目前主要来自家系分析及转基因实验动物模型，本文就引起RS缺陷相关基因及其编码蛋白功能进行综述。
耳蜗外毛细胞(outer hair cell, OHC)负责声音的机械放大过程，内毛细胞负责探测声信号并将其转换为听神经纤维中的一系列动作电位，进而传输到大脑。内毛细胞带状突触是IHC基部与SGNs之间形成的突触，与一般突触不同的是，其突触前膜活化区内锚定有带状电子致密物——ribbon小体，含神经递质谷氨酸(glutamate, Glu)的突触囊泡大量附着于ribbon小体之上。当受到声信号刺激时，毛细胞纤毛发生机械摆动，随之转化为电信号使IHC细胞膜发生去极化，激活突触前膜L型电压门控钙离子通道CaV1.3，Ca2+内流触发Glu的释放，激活突触后膜上由GluR2/3和GluR4亚基组成的AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid)受体，进而成功将声信号从IHC传入中枢，产生听觉[8]。因此，当编码突触相关蛋白的基因改变导致内毛细胞的兴奋无法向听神经传导时，会造成一定程度的听力损失，表现为：耳声发射(otoacoustic emission, OAE)和耳蜗微音器电位(cochlear microphonic potential, CM)可以引出，听觉中枢功能亦正常，但听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR)异常，如：ABR阈值升高，波Ⅰ振幅下降和潜伏期延长[9]。
表1 听突触病相关基因类别及编码蛋白功能
早期对听突触病缺陷基因的关注主要始于一些耳聋家系，后来为了深入研究其发病机制，一些学者通过构建基因敲除动物模型来对疾病进行还原，现在有一些学者还尝试直接构建潜在致病基因敲除动物模型进行探索；
一系列的研究表明，在一个功能正常的内毛细胞RS中，支架蛋白、突触间联系蛋白、突触囊泡装载及释放相关蛋白、谷氨酸受体等都需要及时、准确地装配，其中任何一个环节出现差错都会造成听功能的损失[10]。
2.1骨架相关蛋白及相关基因 Ribeye、Bassoon、Piccolo均是构成RS前膜ribbon小体的支架蛋白[10]，其对应基因分别为CTBP2、BSN、PCLO，其突变或缺失将造成RS成熟障碍或结构异常。Ribeye在突触前Cav1.3通道和ribbon小体正确定位、维持与SGNs联系中发挥重要作用；
起初Sheets等[11]在CTBP2基因敲除的斑马鱼模型中观察到传入神经元中由刺激诱发的动作电位减少、突触前Cav1.3通道丢失的现象；
近来Lv等[12]又证明Ribeye蛋白是Cav1.3通道和ribbon小体正确定位所必需的；
此外，Becker[9]、Jean[13]的两项独立研究均发现CTBP2基因缺失小鼠毛细胞的胞吐功能减弱，表现为中度听力损失。Piccolo和Bassoon是突触前活性区(the active zones, AZs)中最大的两个细胞支架蛋白，参与调控AZs的神经递质释放；
Pic-colo在突触前纤维型肌动蛋白(F-actin，具有调节Cav1.3通道相关的胞吐作用的功能)的动态组装以及突触前蛋白的稳定中扮演重要角色[10]。Butola等[14]研究发现PCLO基因缺陷的RS诱发兴奋性突触后电流(evoked excitatory postsynaptic currents, eEPSC)幅度降低，AZs突触囊泡减少是由于突触囊泡易释放池(readily releasable pool, RRP)减少，证实了Piccolo在AZs囊泡补充中的重要作用。Bassoon也有促进囊泡补充的作用，Frank等[15]发现BSN基因缺陷会导致突触前ribbon小体和相应突触后密度的减少，表现为功能性释放位点数量减少，囊泡RRP补充受到影响；
听力测试为典型的ABR阈值升高和波Ⅰ振幅显著降低，听神经纤维放电率下降[16]。
SMAD4基因是一个明确的转录调控基因和抑癌基因，其编码的Smad4在组织再生、细胞分化、胚胎发育和免疫系统调节中起关键作用。Yang等[17]首先发现SMAD4也是哺乳动物内耳发育和正常听觉功能所必需的。Liu等[18]利用同种基因敲除小鼠进一步研究发现这类小鼠的OHC和突触后SGNs形态接近正常，但突触前后主要结构蛋白几乎完全消失，听功能检查结果符合听突触病的特点，且电极刺激听神经时ABR部分恢复。这些结果表明，SMAD4缺陷会导致RS主要结构蛋白的广泛缺失而致听突触病,提示其他具有转录调控作用的基因也可能成为听突触病的致病基因，这类基因一旦发生突变将造成广泛损失，严重者突触结构完全破坏。
2.2维持突触前、后细胞联系相关基因及蛋白 细胞粘附分子具有建立和维持突触前、后细胞间联系的作用。NPTN基因编码两种突触富集蛋白亚型——neuroplastin-55(Np55)和neuroplastin-65(Np65)是调节包括突触的发生、维持和可塑性在内多个过程的跨膜糖蛋白；
其中Np65在耳蜗内定位于IHCs的突触前区域。小鼠Np65的缺失会导致早发性感音神经性聋，其机制为RS正常发生受阻，成对存在的突触前ribbon小体和突触后传入终末明显减少，囊泡释放率下降，胞吐功能减弱[19]。
神经细胞粘附分子(neuronal cell adhesion molecule，NRCAM)可能在带状突触成熟过程中发挥作用。Harley等[20]发现，NRCAM基因敲除的小鼠在出生后早期，不成熟的ribbon小体明显增多，但随着年龄增长RS趋向于成熟、正常；
因此NRCAM的缺失可能导致RS发育迟缓、听功能成熟滞后。由此可见,不同基因的致病作用不尽相同，基因检测对评估RS的损伤程度及预后有重要作用。
2.3突触小泡谷氨酸装载相关基因及蛋白 SLC17A8基因编码囊泡谷氨酸转运体3(vesicular glutamate transporter3,VGLUT3)，参与Glu的释放活动，负责将Glu装载到突触小泡内以便释放[21]。VGLUT3敲除小鼠的RS中没有Glu的释放活动，表现为OAE正常、ABR缺失[22]；
其发育过程中表现出SGNs数量以及向脑干的投射进行性减少，可能是由于SGNs失去了Glu的营养作用所致[23]。
网格蛋白介导的内吞(clathrin mediated endocytosis, CME)途径是突触区域囊泡回收的主要方式，衔接蛋白AP-2(adaptin-2)是参与调控CME的关键蛋白，由α、β、μ2、σ2四个亚基组成[24]，有研究发现AP-2 mu的缺失造成听力损伤的原因是RS囊泡释放部位的回收及再装载功能受损[25]。
2.4突触小泡释放相关基因及蛋白 OTOF基因发现于一个非综合征型常染色体隐性遗传性聋家系中，它编码的蛋白otoferlin通过C2结构域与Ca2+结合参与膜融合事件，在RS中作为突触囊泡释放与RRP补充的Ca2+感受器，使囊泡膜与突触前膜融合发生胞吐[26]。OTOF基因缺失小鼠听功能严重受损，但内外毛细胞、螺旋神经节、RS结构和Ca2+电流均正常，发病机制为RS胞吐功能缺陷[27,28]。近来Manchanda等[29]学者敲除斑马鱼OTOF基因后其突触前ribbon小体锚定缺陷以及毛细胞内基础Ca2+水平升高。小鼠与斑马鱼表现出不同的RS病理特点也提示otoferlin蛋白在不同物种中的功能差异。
GET1(WRB)基因编码的蛋白介导otoferlin通过跨膜识别复合物途径插入内质网，这一过程是毛细胞胞吐必需的。Lin等[30]和Vogl等[31]在斑马鱼和小鼠IHCs的WRB突变体中发现IHC中otoferlin水平下降，RS中囊泡补充受损导致锚定于ribbon小体的囊泡变少，而Ca2+内流、Ca2+内流-胞吐耦合和囊泡融合均不受影响。
CABP2基因编码Ca2+结合蛋白-2(calcium-binding protein 2,CABP-2)属于与钙调蛋白相关的钙离子结合蛋白家族，正常情况下在RS中CABP-2能抑制Cav1.3通道失活，确保声音信息准确及时的传递[32]。CABP2基因突变会导致人类常染色体隐性耳聋DFNB93[33]，在基因敲除小鼠模型中发现其耳聋机制为：CABP-2缺失导致原本几乎不失活的 Cav1.3通道失活程度提高[34]，声音信息在突触处传递受阻。近期Ortner等[35]发现RIM结合蛋白-2 (RIM-binding protein 2,RBP2) 具有类似的抑制Cav1.3通道失活的效应。
CACNA1D基因编码Cav1.3通道，在耳蜗中介导RS胞吐过程中的Ca2+内流、内毛细胞Ca2+动作电位的产生和一些Ca2+依赖基因表达过程，当人体发生系统性Cav1.3功能异常时表现为综合征型聋[36]。Brandt等[37]研究Cav1.3通道缺失小鼠的IHCs，可见除突触传递功能缺陷外，还存在IHC传入树突结构的成熟障碍和退化；
表明CaV1.3通道对耳蜗内毛细胞的发育和突触前活动均是必不可少的。此外，Eckrich等[38]还发现耳蜗Cav1.3通道的特异性缺失会抑制小鼠内毛细胞分化，导致K+通道成熟障碍。Sheets等[39]研究发现Cav1.3通道缺失或急性阻断导致ribbon小体变大，而通道激活会导致相反结果，表明Cav1.3通道还可以通过控制Ca2+的内流调节突触前膜ribbon小体的大小[39]。
DIAPH3基因编码透明同系物3(diaphanous homolog 3, DIAPH3)在细胞间物质转运及囊泡运输中发挥重要作用，DIAPH3基因也是常染色体显性遗传非综合征型听神经病AUNA1的致病基因，其过度表达可引发典型听神经病的听觉障碍[40]。Schoen等[41]进一步构建DIAPH3基因过表达的转基因小鼠模型重现人AUNA1耳聋，发现突触前ribbon小体的丢失所致胞吐缺陷是产生这种听觉障碍的重要原因。
2.5谷氨酸受体相关基因及蛋白 CLRN1基因编码的产物Clarin-1在耳蜗内定位在毛细胞的顶部和基部，参与受体转运、信号相关分子聚集和支架功能等[42]。研究表明Clarin-1可能参与囊泡运输和突触的发育及维持，CLRN1基因敲除小鼠中观察到突触后AMPA受体的分布异常广泛，同时内毛细胞膜片钳记录显示胞吐缺陷、突触F-actin和Cav1.3通道紊乱[43]。单纯谷氨酸受体缺陷致聋的研究鲜有报道，目前对AMPA受体与听力损失相关的研究主要集中于噪声、缺血、缺氧等，这些因素引起Glu释放过量造成突触后SGNs兴奋性损伤——谷氨酸兴奋性毒性[44]。虽然可以推测AMPA受体遗传缺陷对听功能的负面效应，但是其具体机制、表现还需要进一步的研究来明确。
近年来一系列听突触病相关基因的新发现从分子水平揭示了其病理机制，成为听突触病诊治的重要的分子生物学依据。综合目前对听突触病致病基因的研究来看，引发RS功能异常的基因缺陷种类多，与突触小泡内神经递质Glu的释放障碍相关的占大部分。听突触病中单一位点突变往往带来一系列继发性RS结构或功能损伤，例如突触小泡的锚定障碍势必会引起Glu的释放减少，突触前膜Glu的释放障碍也会引起继发性的SGNs退行性改变或其他功能异常。不同的基因缺陷造成的后果可能是相似的，例如CACNA1D基因和CABP2基因突变导致内毛细胞Ca2+动作电位产生障碍，造成突触前膜胞吐缺陷。依据所致损伤的具体结构、部位不同，对听突触病变不同致病基因进行分类总结，便于分析致病机理。
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