李慧，刘义，陈小玉，黄运安，安玉红，李七星，任国莎，安梅，魏林
（贵州食品工程职业学院，食品资源安全生产技术与综合利用重点实验室，贵州 贵阳 550000）
枇杷[Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl]是蔷薇科植物，其花、果、叶有一定药用价值。成熟枇杷鲜果酸甜可口、营养物质丰富，不仅有止咳润肺、延缓衰老等生理功效[1]，还有一定的抗动脉硬化、抗血栓等生物活性及皮肤保健和美容等功效[2]。但枇杷多在5月～7月集中成熟，季节性较强，且果皮薄，鲜果储运过程中易受机械损伤，发生褐变甚至腐败[3]，所以很多学者一直高度关注枇杷的精深加工研究[4]。益生菌具有调节人体肠道菌群平衡及抗肿瘤等生物功能[5-7]，现在使用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）等发酵果汁的研究较多。通过益生菌发酵果汁，可使果汁中结合态多酚变为游离态多酚，增加果汁中功能成分含量[8-9]，并且产生令人愉悦的发酵风味，此外，还可生成丰富的维生素、乳酸菌素、消化酶等多种有益物质，使饮料具有一定的健肠胃、助消化及增强免疫力的功效[10-12]。综上，对比不同种类益生菌发酵后果汁的抗氧化活性等物质含量，探究最优发酵菌种，对实际生产工作具有重大意义。
本研究以新鲜枇杷浆为对象，使用植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌进行发酵试验，测定不同菌种处理后，枇杷浆发酵过程中pH值、总酸等物质含量变化，分析枇杷发酵过程中活性成分的变化；
并通过监测1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐阳离子[2，2"-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate） cation，ABTS+]自由基清除率变化，评价发酵枇杷浆的抗氧化活性变化，为发酵枇杷的综合开发提供参考。
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌种
枇杷：产自贵州黔西南州晴隆县；
嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌：上海保藏生物技术中心。
1.1.2 试剂
MRS培养基、MRS液体培养基：北京奥博星生物技术有限公司；
酒石酸钾钠、苯酚、氢氧化钠：成都金山化学试剂有限公司；
乙醇：天津市富宇精细化工有限公司；
没食子酸、葡萄糖、无水亚硫酸钠、亚硝酸钠、甲醇：天津市科密欧化学试剂有限公司；
福林酚试剂：北京索莱宝科技有限公司；
3，5-二硝基水杨酸：阿拉丁控股集团有限公司；
碳酸钠、碳酸氢钠：天津市永大化学试剂有限公司；
奎诺二甲基丙烯酸、2，2-联苯基-1-苦基肼基、硝酸铝：上海麦克林生化科技有限公司；
盐酸：成都市科隆化学品有限公司；
芦丁标准品（98%）：成都曼思特生物科技有限公司。以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-2FD洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；
DHP-9272B微生物恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；
722G紫外分光光度计、PHS-3C pH计：上海仪电分析仪器有限公司；
GR85DA立式自动压力蒸汽灭菌器：致微（厦门）仪器有限公司；
HHS-11-6电热恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；
CP214电子天平：奥豪斯仪器（常州）有限公司；
JYL-C93T榨汁机：九阳股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 乳酸菌生长曲线的绘制
以6%的接种量将3种活化后的乳酸菌接入250mL MRS液体培养基中，以未接种菌种的MRS液体培养基作为空白对照，37℃恒温培养，每隔2h测定其在600nm处的OD值，菌种进入稳定期后每隔4 h测定1次。以生长时间（h）为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制3株乳酸菌的生长曲线。
1.3.2 发酵种子液的制备
将连续活化3代以上的乳酸菌按照6%的接种量接种进行扩大培养（37℃，24 h～36 h），得到乳酸菌菌悬液（菌悬液浓度≥1×107CFU/mL）备用。
1.3.3 枇杷浆的制备
挑选新鲜、硬度适中的枇杷清水漂洗沥干，去核，按枇杷与水1∶2的质量比进行打汁。将枇杷浆放入灭菌锅中灭菌（108℃、15 min）后备用。
1.3.4 枇杷浆的菌种接种和发酵
分别以6%的接种量接种嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌，以未接种的枇杷浆为空白对照。在37℃恒温培养箱静置发酵48 h，每6 h取样1次进行测定，刚接入菌液后的时间记为0 h。
1.3.5 感官评价
感官评价采用9分制的评分方法[13]，满分36分。邀请9名具有食品发酵相关专业知识的品评员对发酵枇杷浆进行感官品评，评分细则详见表1。
表1 发酵枇杷浆感官评价标准Table 1 Sensory evaluation criteria of fermented loquat pulp
续表1 发酵枇杷浆感官评价标准Continue table 1 Sensory evaluation criteria of fermented loquat pulp
1.3.6 指标测定
1.3.6.1 pH值的测定
采用pH计直接测定。
1.3.6.2 总酸含量的测定
参考GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》法进行测定。
1.3.6.3 总糖含量的测定
参考王明瑞等[14]的试验方法进行测定。
1.3.6.4 总酚含量的测定
参考唐思颉等[15]的方法，采用福林-酚比色法测定，以没食子酸作为标准品制作标准曲线（y=0.628 9x+0.019 2，R2=0.997 9）。每1 mL枇杷浆发酵液中总多酚含量以没食子酸记，单位为mg/L，重复试验3次，取平均值。
1.3.6.5 总黄酮含量的测定
参考孙巍等[16]的方法，采用NaNO2-Al（NO3）3比色法测定样品中总黄酮的含量。以芦丁作为标准品制作标准曲线（y=0.628 9x+0.019 2，R2=0.997 9）。取 1.00 mL的枇杷浆发酵液置于10 mL试管中，乙醇（体积分数30%）补足至5 mL，加入NaNO2溶液（质量分数5%）0.3 mL，摇匀，静置8 min，加Al（NO3）3溶液（质量分数10%）0.3 mL，摇匀，静置8 min，加NaOH 溶液（质量分数4%）4 mL，蒸馏水定容（加0.4 mL蒸馏水使总体积为10 mL），摇匀，静置15 min。以芦丁记，单位为mg/L，重复试验3次，取平均值。
1.3.6.6 DPPH自由基清除率的测定
参考许长谋[17]的方法稍作修改，根据DPPH自由基百分率与Trolox溶液浓度做标准曲线（y=0.628 9x+0.019 2，R2=0.997 9）。DPPH自由基清除率评价根据Brand-Williams等[18]的方法并略做修改。分别取7.8 mL DPPH-甲醇溶液和200 μL样液先后加入同一10 mL棕色容量瓶中，混匀。于室温（25±2）℃暗处反应60min后在515 nm处测定吸光度。对照组：样液以200 μL空白提取液代替。重复试验3次，取平均值。
1.3.6.7 ABTS+自由基清除率的测定
参照Tai等[19]的方法进行测定。
1.4 数据分析
采用Origin 8.6软件绘制图表，SPSS 21.0软件进行pearson相关性分析。
2.1 不同乳酸菌的生长曲线
3种乳酸菌生长曲线见图1。
图1 3种乳酸菌的生长曲线Fig.1 Growth curves of three lactic acid bacteria
由图1可知，植物乳杆菌在MRS液体培养基中未出现明显滞后期，20 h内进入稳定期，从对数生长期进入稳定期的过渡时间较短。嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌与植物乳杆菌相比，滞后期相对较长，约在6 h进入对数生长期，24 h后逐渐进入稳定期，且从对数生长期到稳定期需要一定时间，测试时间内菌体数量相对较少。因此，相较于保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌，植物乳杆菌活力更高，可更快适应枇杷浆环境。
2.2 乳酸菌发酵对枇杷浆感官评分的影响
不同乳酸菌发酵枇杷浆过程中感官评分的变化见图2。
由图2可知，对照组枇杷浆的感官评分一直稳定在24左右。植物乳杆菌发酵的枇杷浆感官评分持续上升，30 h时达最高，为34，之后有所下降，至48 h时降至最低，为29。保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵的枇杷浆感官评分持续上升，36 h时达到最高，为33，最终在48 h时分别降至28和30。3种菌株的发酵液在发酵过程中的感官评分明显高于对照组，这是由于枇杷汁经过益生菌发酵，产生了醇类、酯类、醛类、酮类和酚类等呈香物质，赋予枇杷浆更强烈的果香、清香和花香[19-20]。
图2 不同乳酸菌发酵枇杷浆感官评分的变化Fig.2 Changes in sensory properties of Eriobotrya japonica pulp during fermentation by different lactic acid bacteria
2.3 乳酸菌发酵对枇杷浆pH值及总酸含量的影响
初始pH值会影响枇杷浆的颜色，在最大限度保证色泽的同时，为给菌种提供合适的初始pH值，选择用NaHCO3将初始枇杷浆的pH值调整为4.5～5.0之间。不同乳酸菌发酵枇杷浆过程中pH值的变化见图3。
图3 不同乳酸菌发酵枇杷浆pH值的变化Fig.3 Changes in pH of Eriobotrya japonica pulp during fermentation by different lactic acid bacteria
如图3所示，3株乳酸菌在发酵过程中由于乳酸菌代谢产生乳酸等有机酸，pH值整体呈现下降趋势。其中植物乳杆菌发酵的枇杷浆pH值在6 h内基本稳定，而6 h后枇杷浆的pH值开始降低，且速率较快，这与Nagpal等[21]的研究结果一致，植物乳杆菌对果汁进行发酵后可把环境pH值降至更低，相关研究表明，植物乳杆菌发酵果蔬的过程，往往伴随着苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF）的二次发酵，可进一步降低环境体系的pH值[21]。保加利亚乳杆菌发酵的枇杷浆在12 h内pH值基本稳定，在12 h～18 h之间明显下降，但pH值高于植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌组。对照图1生长曲线，保加利亚乳杆菌数量较植物乳酸菌和嗜酸乳杆菌少，产酸较少，且随着发酵时间的延长，pH值逐渐降低，抑制了菌种的活力及代谢能力。由此可得，嗜酸乳杆菌发酵的枇杷浆pH值下降最多、植物乳杆菌次之、保加利亚乳杆菌下降最少。
不同乳酸菌发酵枇杷浆过程中总酸含量的变化见图4。
图4 不同乳酸菌发酵枇杷浆总酸含量的变化Fig.4 Changes in titratable acid content of Eriobotrya japonica pulp during fermentation by different lactic acid bacteria
由图4可知，对照组在0～48 h内总酸含量基本平缓。保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵过程中，总酸含量最高达到18.80 g/L和19.10 g/L，植物乳杆菌发酵过程中，对比其他两个菌种组其总酸含量较低，最高为17.60g/L。3种乳酸菌发酵组与对照组的总酸含量差别较大，整体呈现上升的趋势，说明3种菌在以枇杷浆为基质的发酵过程中产酸能力均较强[22]。
2.4 不同乳酸菌发酵对枇杷浆总糖含量的影响
不同乳酸菌发酵枇杷浆过程中总糖含量的变化见图5。
图5 不同乳酸菌发酵枇杷浆总糖含量的变化Fig.5 Changes in the total sugar content of Eriobotrya japonica pulp during fermentation by different lactic acid bacteria
由图5可知，3株乳酸菌在发酵过程中总糖含量均存在先上升后下降的波动变化。在发酵过程中保加利亚乳杆菌在24 h时总糖含量最高，为2.90 mg/mL；
嗜酸乳杆菌在36 h时总糖含量最高，为3.60 mg/mL；
植物乳杆菌在42 h时总糖含量最高，为3.10 mg/mL。在发酵后期，随着pH值下降，总糖含量也相应降低，说明在酸性环境中乳酸菌仍处于分解代谢中。
2.5 不同乳酸菌发酵对枇杷浆中总酚含量的影响
不同乳酸菌发酵枇杷浆过程中总酚含量的变化见图6。
图6 不同乳酸菌发酵枇杷浆总酚含量的变化Fig.6 Changes in the total phenol content of Eriobotrya japonica pulp during fermentation by different lactic acid bacteria
如图6所示，3组样品的总酚含量在0～48 h内整体呈现下降趋势。植物乳杆菌发酵液在30 h内总酚含量一直呈现下降的趋势，而在30 h后开始平稳，至48 h时总酚含量为180.63 mg/L。保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵的枇杷浆在48 h时总酚分别下降至173.25 mg/L和175.18 mg/L。3个菌种发酵过程中，总酚含量整体呈现下降趋势，可能是由于乳酸菌发酵产生了丙酮酸、乙醛等次级代谢产物，与多酚类物质（包括黄酮）发生反应形成了一些大分子衍生物使得总酚含量降低。另外，微生物发酵产生的酶也会降解枇杷浆中多酚类物质，引起多酚类物质含量降低[23-24]。
2.6 不同乳酸菌发酵对枇杷浆总黄酮含量的影响
不同乳酸菌在发酵枇杷浆过程中总黄酮含量的变化见图7。
由图7可知，3组样品的总黄酮含量在48 h内呈现整体下降趋势。发酵至48 h时，植物乳杆菌发酵液总黄酮含量最多，为2.40 mg/L；
保加利亚乳杆菌发酵液总黄酮含量次之，为2.30 mg/L；
嗜酸乳杆菌发酵液总黄酮含量最低，为2.13 mg/L。总黄酮含量与总酚含量在发酵48 h时均呈现下降的状态，且原因相似。
图7 不同乳酸菌发酵的枇杷浆总黄酮含量的变化Fig.7 Changes in the total flavonoids content of Eriobotrya japonica pulp during fermentation by different lactic acid bacteria
2.7 不同乳酸菌发酵对枇杷浆DPPH自由基清除率的影响
不同乳酸菌发酵枇杷浆过程中DPPH自由基清除能力的变化见图8。
图8 不同乳酸菌发酵的枇杷浆DPPH自由基清除能力的变化Fig.8 Changes in scavenging DPPH radical of Eriobotrya japonica pulp during fermentation by different lactic acid bacteria
如图8所示，3个发酵组在48 h内DPPH自由基清除率整体逐渐降低。发酵至48 h时，3组的DPPH自由基清除率均低于对照组，其中保加利亚乳杆菌发酵液DPPH由基清除率下降最多，在48 h时降至32.66%；
植物乳杆菌次之，为32.98%；
嗜酸乳杆菌下降最少，为33.51%。结合图6和图7，总酚、总黄酮含量在48 h时均降低，说明总酚和总黄酮含量对DPPH自由基清除能力有一定影响。研究表明，酚类化合物增强自由基的清除能力，对激发态氧分子有猝灭作用，以水果为基质的发酵体系抗氧化能力还可能与乳酸菌生长代谢过程中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽酶等抗氧化酶的产出有一定关系[25-27]，可在后续开展进一步探讨。
2.8 不同乳酸菌发酵对枇杷浆ABTS+自由基清除率的影响
不同乳酸菌发酵枇杷浆ABTS+自由基清除率的变化如图9所示。
图9 不同乳酸菌发酵枇杷浆ABTS+自由基清除能力的变化Fig.9 Changes in scavenging ABTS+radical of Eriobotrya japonica pulp during fermentation by different lactic acid bacteria
如图9所示，相对于对照组，3株菌发酵后枇杷浆中的ABTS+自由基清除率总体呈下降趋势。0 h时，对照组的ABTS+自由基清除率约为52.88%，可见新鲜枇杷浆的抗氧化能力较强。随着发酵时间的延长，植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌及嗜酸乳杆菌分别在42、48 h及42 h出现最低值为50.00%、50.47%及51.03%，尽管发酵后ABTS+自由基清除率下降，但下降幅度仅为初始值的4.5%左右，可见不同乳酸菌发酵后对于ABTS+自由基影响并不大，能较好地保持枇杷浆抗氧化活力。
2.9 不同乳酸菌发酵枇杷浆过程中各指标的相关性分析
利用SPSS 21.0分别对3个发酵组的部分指标进行相关性分析，结果见表2～表4。
由表2～表4可知，3个发酵组的DPPH自由基清除率与总酚含量呈极显著相关（P＜0.01），说明抗氧化活性受总酚含量影响较大。同时3个发酵组中的总黄酮含量、总酸含量及pH值和抗氧化活性均有一定相关性，说明3株乳酸菌发酵时多指标存在较强的相关性。如植物乳杆菌发酵后，DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率与pH值呈极显著正相关，说明pH值越大枇杷浆发酵液的抗氧化活性越强，推测低pH值对植物乳杆菌的生长及发酵液中抗氧化活性物质有一定影响。同时，在反映抗氧化活性的DPPH·清除率与ABTS+·清除率两个值之间，存在着极显著的相关性，说明乳酸菌发酵后的枇杷浆，抗氧化活性相关指标变化趋势一致。综上，在枇杷浆乳酸菌发酵过程中抗氧化能力由体系的综合环境决定，尤其是总酚含量与pH值的变化。
表2 嗜酸乳杆菌发酵枇杷浆各指标与抗氧化活性的相关性分析Table 2 Correlation analysis of various indexes and antioxidant activity of Eriobotrya japonica pulp during fermentation by Lactobacillus acidophilus
表3 植物乳杆菌发酵枇杷浆各指标与抗氧化活性的相关性分析Table 3 Correlation analysis of various indexes and antioxidant activity of Eriobotrya japonica pulp during fermentation by Lactobacillus plantarum
表4 保加利亚乳杆菌发酵枇杷浆各指标与抗氧化活性的相关性分析Table 4 Correlation analysis of various indexes and antioxidant activity of Eriobotrya japonica pulp during fermentation by Lactobacillus bulgaricus
本研究以季节性较强、不易贮存的枇杷为原料，研究3种乳酸菌在发酵枇杷浆过程中酸度、活性物质含量、感官评分及抗氧化活性的变化情况。从结果分析可以得到，3株乳酸菌的生长活力由强至弱顺序为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌。嗜酸乳杆菌发酵的枇杷浆pH值下降最多、植物乳杆菌次之、保加利亚乳杆菌下降最少，结合生长曲线分析说明植物乳杆菌发酵能力较强，且能够适应一定酸性胁迫环境。乳酸菌发酵后，对枇杷浆中总酚含量、总黄酮含量、DPPH自由基清除率、ABTS+·清除率均有不同影响，说明不同乳酸菌发酵后对枇杷浆品质影响不同，可能是由于不同菌株的代谢能力不同。其中植物乳杆菌抗氧化活性相对较高，通过指标测定显示：植物乳杆菌发酵枇杷浆后，总黄酮含量、总酚含量、总糖含量、DPPH自由基清除率、ABTS+·清除率总体变化趋势较好，利于保证发酵果汁抗氧化活性。3株乳酸菌发酵后，感官评分也有不同程度变化，感官评分最高值出现在植物乳杆菌中，通过色泽、气味、口感及可接受性评分，植物乳杆菌发酵30 h后出现感官评分最高值。
综上所述，乳酸菌发酵可降低枇杷浆体系的pH值，产出酸性物质，分解利用碳源，辅助减缓活性物质的降低，辅助维持抗氧化活性，尤其是本文研究的3株乳酸菌中的植物乳杆菌，综合各指标考虑，可用于枇杷浆发酵的进一步研究。除上述3种乳酸菌外，其他乳酸菌、酵母菌等有益菌对水果的发酵性能及发酵品质均有所助益，也需进一步研究，以期更好地将发酵技术应用到枇杷产业。
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