任明 保积英 贾晨阳 张尉华，4
(1青海大学附属医院心内科，青海 西宁 810001；
2青海省人民医院心内科；
3宝鸡市中心医院老年心脑血管病科；
4吉林大学第一医院心内科)
高原的低氧气候环境可直接影响人类的身体健康，对于人体的重要组织器官〔1～3〕、关键的调节分子及遗传物质〔4，5〕、肠道菌群的种类及数量均产生影响〔6～8〕，高原从各个方面影响人体的身体健康〔9，10〕。高原习服是机体适应高原环境的过程，是机体为了适应高原低氧低压环境而发生的相应变化〔11〕。平原人移居高原后会因海拔高度、暴露时间、气候条件、登高速度、营养状况、个体差异等众多因素的不同产生不同的适应结果〔12〕。越来越多的研究认为能量代谢对生活在高原低氧环境中的物种的生存起着重要作用〔13〕，认为高原习服中物质代谢及能量代谢的有效调节在高原习服过程中是最为关键的〔14～17〕。
肝脏中含有大量的参与脂肪酸代谢的酶类及其上游转录因子，乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、棕榈酰基转移酶(CPT)分别是脂肪酸合成与氧化的关键酶〔18，19〕。AMP激活的蛋白激酶(AMPK)也是表达于肝脏中的一类蛋白激酶，参与脂肪酸代谢调控。ACC是AMPK的靶蛋白，AMPK被发现可以使ACC失活，从而使丙二酰辅酶(Malonyl)-A含量降低，使Malonyl-A对CPT-1的抑制作用减弱，使脂肪酸的β-氧化过程增强。脂肪酸代谢在缺氧环境中对碳水化合物起着很重要的补充作用〔20〕。研究证实，低氧刺激会激活AMPK，进而对下游靶蛋白实现调控功能，最终维持机体能量平衡。在低氧环境下参与脂肪酸代谢的相关蛋白主要受到海拔高度及暴露时间的影响。本研究设置了低、中、高海拔及不同暴露时间，同时在以往实验的基础上增加样本含量，动态观察大鼠肝组织中参与肝脏脂肪酸相关指标的水平变化，探讨中高海拔地区不同暴露时间下肝脏脂肪酸代谢特点。
1.1实验动物与材料 健康成年SPF级雄性SD大鼠110只，体质量168～206 g，购于西安站梦生物科技有限公司。酶标仪、聚合酶链反应(PCR)仪、蛋白转膜仪购自Bio-Rad公司。凝胶成像系统购自上海天能有限公司。漩涡混合器购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司。RT-PCR仪购自ABI公司。电泳仪购自北京六一公司。电热恒温培养箱购自上海精宏试验设备有限公司。化学发光成像仪系统购自上海勤翔科学仪器有限公司。大鼠酮体(KB)、游离脂肪酸(FFA)、丙氨酸转氨酶(ALT)检测试剂盒购自南京建成有限公司。重组Anti-CPT1A抗体、山羊抗兔IgG H&L、重组Anti-Acetyl Coenzyme A Carboxylase抗体、Anti-AMPK alpha 1抗体、Anti-低氧诱导因子(HIF)-1 alpha抗体购自Abcam公司。beta-Actin Loading Control antibody Mouse MAb购自义翘神州有限公司。
1.2动物分组与处理 根据饲养环境不同分为对照组(n=10)及中、高海拔组(中、高海拔组又分别分为1、3、7、15、30 d组5个亚组各10只)。对照组在西安交通大学医学部运动实验中心动物房(海拔400 m)饲养30 d；
中、高海拔1、3、7、15、30 d组分别在青海大学医学院高原医学中心动物房(海拔2 260 m)和玛多县人民医院(海拔4 200 m)饲养1、3、7、15、30 d。各组大鼠居住和饮食条件均一致，室温25℃，空气流通，摄食及饮食自由，有专业人员给予定期消毒，饲养过程中无动物死亡。饲养的各环节均遵循各动物实验中心要求。本研究经青海大学附属医院伦理委员会批准，并按照国家卫生部动物管理条例进行。大鼠分别在达到实验规定的暴露时间后，给予水合氯醛腹腔注射麻醉，从心脏抽取血液4 ml于抗凝管内，用低温高速离心机3 000 r/min离心10 min，取上清液于冻存管内，置于-80℃冰箱内；
随后取大鼠适量肝组织置于-80℃冰箱中保存备用。
1.3血浆ALT、NEFA及肝组织中KB测定 采用ALT试剂盒、KB试剂盒和NEFA试剂盒分别检测血浆中的ALT、NEFA及肝组织中的KB，严格按照试剂盒操作步骤进行。
1.4AMPK、ACC-1、CPT-1、HIF-1α mRNA检测 将肝组织在液氮急速冷冻后研磨成粉，取50 mg加入含有Trizol试剂1 ml的离心管中，混匀，室温放置15 min以上。加入200 μl的氯仿，颠倒混匀后室温放置5 min。4℃、12 000 r/min离心15 min。吸取上清至新的离心管中，加入等体积异丙醇混匀，-20℃放置60 min。4℃、12 000 r/min离心15 min去上清液。加入75%乙醇洗涤，4℃、12 000 r/min离心15 min去上清液，用RNase free的水溶解沉淀。核酸蛋白定量仪检测RNA浓度，琼脂糖电泳检测RNA完整性。取总RNA 800 ng，加入1 μl引物(0.1 μg/μl)、10 μl 2×TS Reaction Mix、1 μl TransScript@RT/RI Enzyme Mix、1 μl TransScript@RT/RI Enzyme Mix、加RNase-free水至总体积为20 μl。轻轻混匀，25℃反应10 min，85℃反应5 s取出。将合成cDNA置于-80℃保存，后续荧光定量检测的样本cDNA使用RNase-free Water按照1∶1稀释进行反应。引物序列见表1。PCR体系包括Evagreen 2×qPCR Master Mix(10 μl)、上下游引物(各0.6 μl)、cDNA(2 μl)、无RNA酶水(6.8 μl)。PCR反应条件：预变性95℃ 10 min；
变性95℃，5 s，40个循环；
退火/延伸60℃，30 s，40个循环。
待测基因引物序列β-Actin：正向5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′,反向5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′;ACC1：正向5′-TTGGACAACGCCTTCAC-3′,反向5′-GCAGCCCATTACTTCATCA-3′;CPT：正向5′-AGGTCGGAA GCCCATGTTGTA-3′,反向5′-GCTGTCATGCGCTGGAAGTC-3′;AMPK：正向5′-AACCTGAAAACGTCCTGCT-3′,反向5′-CGCTGCTCCAGATGTCTAC-3′;HIF：正向5′-GCATCTCCACCTTCTACCC-3′,反向5′-TCTTTCCTGCTCTGTCTGG-3′。
1.5AMPK、ACC-1、CPT-1、HIF-1α蛋白检测 肝组织样本研磨后，取100 mg加入到预冷的1.5 ml离心管中，加入400 μl RIPA裂解液，充分混匀，4℃放置60 min后，4℃下12 000 r/min离心15 min收集上清。二喹啉甲酸(BCA)测定蛋白浓度。样本加入适量5×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上样缓冲液(含β-巯基乙醇)，100℃沸水加热处理5 min，使蛋白充分变性，12 000 r/min离心5 min，取上清备用。预染蛋白Marker 9 μl，样品每孔上样蛋白50 μg。电泳结束后，转膜时采用恒压转膜，电压100 V，使用0.45 μm的聚偏氟乙烯(PVDF)膜。AMPK、β-actin(内参)转膜时间为60 min，CPT-1、HIF-1α转膜时间为90 min，ACC-1转膜时间为150 min。使用含5%脱脂奶粉的封闭液，封闭转印膜1 h，然后TBST洗3次，5 min/次。加一抗4℃孵育过夜后加入二抗，室温孵育1 h，漂洗3次，将显色液A液和B液混合，加2 ml至膜上，用ChemiScope mini化学发光仪检测、拍照。使用Quantity One软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值比值表示目的蛋白相对表达量。
1.6统计学处理 采用SPSS23.0软件进行单因素方差分析、LSD-t或TamhaneT2检验。
2.1不同海拔习服过程中大鼠血浆ALT及FFA含量 中海拔和高海拔暴露期间，各组血浆中ALT、FFA含量与对照组相比无显著差异(P>0.05)。见表1。
2.2不同海拔习服过程中大鼠肝脏HIF-1α、AMPK、ACC1、CPT-1 mRNA表达 与对照组比较，HIF-1α mRNA在中、高海拔暴露的1、3、7、15 d显著升高；
与对照组比较，AMPK mRNA在中海拔暴露的1、3、7、30 d及高海拔暴露的1、3、7、15、30 d显著降低；
高海拔暴露第15天显著低于中海拔暴露第15天；
与对照组比较，ACC1 mRNA在中、高海拔暴露的1、3 d显著升高，且高海拔暴露1、3 d显著高于中海拔暴露1、3 d；
与对照组比较，CPT-1 mRNA在中海拔暴露的3 d显著升高，15 d显著降低；
在高海拔暴露的3 d显著升高，第7、15天显著降低；
高海拔暴露3 d显著高于中海拔的3 d，高海拔暴露7、15 d显著低于中海拔7、15 d(P<0.05)。见表1。
表1 各组血浆ALT、FFA含量及AMPK、ACC-1、CPT-1、HIF-1α mRNA表达水平比较
2.3不同海拔习服过程中大鼠肝脏KB含量 与对照组比较，中海拔各组肝脏KB均无显著差异(P>0.05)；
高海拔3 d组KB含量显著高于对照组及高海拔1 d组(P<0.05)；
至暴露第7天开始恢复正常。见表2。
2.4不同海拔习服过程中大鼠肝脏HIF-1α、AMPK、ACC1、CPT-1蛋白表达 与对照组比较，HIF-1α蛋白在中海拔3 d显著升高，高海拔暴露1、3 d显著升高，且显著高于中海拔组1、3 d；
与对照组比较，AMPK蛋白在中海拔暴露3、7、15、30 d及高海拔暴露1、3、7、15、30 d显著降低；
高海拔暴露各组显著低于中海拔各组；
与对照组比较，ACC1蛋白在中海拔暴露3 d显著升高，在高海拔暴露1、3 d显著升高，且显著高于中海拔暴露1、3 d；
与对照组比较，CPT-1蛋白在中海拔暴露3 d显著升高；
在高海拔暴露3 d显著升高，第7天开始降低，第15天显著降低；
高海拔暴露第7、15天显著低于中海拔第7、15天(P<0.05)。见表2。
表2 各组肝脏组织中KB含量及AMPK、ACC-1、CPT-1、HIF-1α蛋白表达水平比较
高原低氧对能量代谢的影响主要表现为多种代谢产物和关键酶的显著变化〔21〕，能量代谢对生活在高原低氧环境中的物种的生存起着重要作用，代谢调节能有效提高机体对低压缺氧的适应性反应。在青藏高原可可西里自然保护区(4 630 m)和拉吉山脚(2 600 m)设陷阱捕获了10只鼠兔，生活在海拔4 630 m的鼠兔体内，涉及碳水化合物、脂肪、能量和氧化还原稳态通路的几种代谢物发生了显著的改变〔22〕。并且有研究认为新陈代谢的适应，是人类进化到高海拔生活的基础〔23〕。越来越多的研究试图确定高原适应的遗传基础，并共同提出这种适应是通过改变多个分子机制发生的，人们意识到适应不仅涉及氧输送的变化，而且还涉及在细胞水平上改变氧利用的代谢改变〔24〕。
高原低氧习服是机体是在低氧低压环境下发生的可逆的适应性变化〔11〕。适应高原低氧的过程受到众多因素的影响，而海拔高度和低氧暴露的时间是最重要的影响因素〔12〕。目前研究更多集中于高原习服过程中能量代谢模式的转变，发现提高氧气利用率可以更好适应低氧环境〔4〕。
有学者研究显示，慢性高原暴露(4 300 m，8 w)高脂饮食组与高原暴露正常饮食组的大鼠肝组织磷酸化(p)-AMPK表达明显高于对照组，而与非高原暴露高脂饮食组比较差异无显著性，证明低氧环境下会激活AMPK的活性〔25，26〕。本研究结果提示，低氧的存在会抑制AMPK的表达，且海拔越高抑制越明显。而对于AMPK的磷酸化水平未予以评估。ACC-1作为AMPK的下游靶蛋白大量表达于肝脏，催化乙酰辅酶A为转化为Malonyl-A。激活的AMPK通过磷酸化及基因表达调控ACC-1抑制脂肪酸合成代谢〔27〕。本研究结果提示，大鼠肝脏脂肪酸的合成在中海拔早期会有暂时的增强，以满足更多的能量需求。在高海拔早期肝脏脂肪酸合成代谢可能增强，之后恢复至对照组水平。但AMPK一直呈低表达，提示在此过程ACC-1可能还受到其他系统的调控。同时同一暴露时间下海拔越高ACC1表达越高，脂肪酸的合成能力可能越强。CPT1是进行β氧化的限速酶。CPT1活性受Malonyl-A抑制，从而抑制β氧化。酮体是肝脏中氧化分解的中间产物，通过观察期变化水平间接了解脂肪酸氧化水平。本研究结果提示，中海拔地区由于低氧状态很快被纠正，肝脏脂肪酸氧化代谢增强的持续时间短暂，并且程度较弱。早期高海拔组CPT1 mRNA表达及蛋白表达呈现一过性增，但与中海拔不同的是从暴露的第7天开始CPT1 mRNA表达及蛋白表达逐渐降低，至暴露15 d最低，至30 d又恢复对照组水平，呈现先升高后降低再恢复至对照组的趋势。而肝脏酮体在高海拔急性期显著升高，后期恢复对照水平。本研究结果提示，脂肪酸的氧化能力在中、高海拔早期可能升高，在中海拔很快就恢复到正常组水平，而在高海拔组中却发现在高原暴露的第15天却降至最低，但酮体的水平却没有发生这种变化。因此尚不能判断CPT-1的这种变化是否代表脂肪酸的氧化过程。目前更多的研究发现过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α，是CPT的上游调控因子〔8〕。夏尔巴人单倍型与骨骼肌PPARα及其靶点CPT1B表达降低有关，导致线粒体有氧氧化降低〔24〕。本研究未涉及该通路，以后可对低氧下肝脏组织中PPARα/CPT-1通路进行深入研究。
关于脂肪酸代谢尤其是氧化代谢在低氧环境下的研究有很多，但都没有统一的认识。一项模拟低氧的研究发现〔28〕，大黄鱼在急性低氧应激(96 h内)条件下，可能由于持续时间很短，肝脏对脂质利用没有显著变化。考虑到高原通常还伴有低温，研究指出高原鼠兔在相同的体重下，冬季的消耗量比夏季低29.7%，使它们在冬季的代谢范围异常低。一项冷缺氧相关研究显示，暴露1 d和暴露7 d大鼠的肌肉和肝脏中CPT1表达显著减少，认为脂肪酸代谢、氧化代谢水平降低可能是动物低代谢状态的原因〔29〕。有学者发现，将肝细胞暴露于1% O2可降低CPT1 mRNA表达，抑制氧化代谢，诱导小鼠肝脏脂肪积聚，而对脂肪酸的合成无显著影响〔30〕。本研究结果提示，在中、高海拔低氧急性暴露下(3 d)，参与脂肪酸合成与氧化的关键酶表达均增加，但中、高海拔组由于缺氧状态很快被纠正(HIF-1α很快恢复到非暴露水平)，持续时间短暂，随后恢复到对照组水平。在短期低氧应激期间，肝脏呼吸容量增强和脂质代谢改变支持代谢稳态。另外喜马拉雅夏尔巴人是西藏后裔，非常适应高海拔低压缺氧的生活。与低地种群相比，组织氧输送明显增强，此外发现组织氧利用(即代谢适应)的差异同样支持这种适应，与低地人相比，夏尔巴人在骨骼肌活组织检查中显示出较低的脂肪酸氧化能力，同时提高了氧气利用效率，改善了肌肉能量代谢，以及防止氧化应激〔15〕。高原鼢鼠一生都生活在地下密封的洞穴中，氧气非常的有限，与褐鼠相比，高原鼢鼠的能量代谢相关基因(如线粒体和脂肪酸β氧化)进化速度加快〔31〕。以上实验均提示，在氧供应不足的情况下机体内的能量代谢过程错综复杂，这个除了不同的实验设计导致的结果差异外，另外有文献报道，即使在相同的海拔下，季节差异〔32〕、年龄性别差异及不同研究对象都会导致不同的结果〔29，33～35〕。宏基因组学预测显示，高原鼠兔中大部分与新陈代谢(如能量代谢和脂质代谢)有关的基因功能在冬季较少，从而降低能量需求〔10〕。另外高原环境具有多种混杂因素，高海拔环境并不是单独研究缺氧生理反应的理想环境〔36〕，如高海拔地区活动或饮食的变化，未来的研究可将不同的低氧方案与可控的活动/不活动和饮食相结合。
也有研究支持的结果和本研究相似。在慢性暴露于模拟海拔5 500 m，2个月的大鼠，肝脏和骨骼肌中脂肪酸的氧化水平增加〔37〕。海拔4 300 m慢性暴露(8 w)，使AMPK活化，进而使CPT1表达增加，纠正非酒精性脂肪肝的脂质的形成〔9〕。一项研究通过转录组学的方法，研究了布氏田鼠骨骼肌组织对低氧环境的反应，发现其通过加强磷酸戊糖途径和线粒体的脂肪酸合成途径来维持身体的能量供应〔15〕。藏羊作为青藏高原适应较好的物种，与汉羊相比，藏羊肝脏中脂肪酸氧化能力较强，以应对青藏高原恶劣环境下的低能量摄入〔38〕。在高海拔地区，藏猪的能量代谢相关的代谢途径(包括脂肪酸的氧化)不断增加〔39〕。此外，恶性肿瘤会使体内的脂肪酸持续合成，需要满足能量需求，而ACC控制这一过程，从而研究提出ACC抑制剂有望用于肿瘤治疗〔40〕。以上研究与本文得出相似结果，提示只要氧气供应不足，机体脂肪酸氧化会增强，因为这样会产生更多的能量。另外，本研究发现肝脏内CPT1蛋白表达变化趋势与HIF-1α一致。一项肾透明细胞癌相关研究指出，CPT1A是HIF-1和HIF-2复合物的直接靶基因，并且在肿瘤细胞中被抑制，弱化脂肪酸的分解代谢，但在真实的高原暴露下两者的关系有待深入研究。
综上，中、高海拔地区与平原地区大鼠脂肪酸代谢存在差异。不同氧浓度下的脂肪酸代谢变化规律及机制错综复杂，以后研究应深入探讨其分子机制，以便更好地适应高原低氧环境。
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