杨 彦，徐 斌，李玉霞，唐运祥，杨 钱
(重庆市急救医疗中心/重庆市第四人民医院:1.肿瘤血液科；
2.核医学科；
3.普通外科 400014)
作为内分泌系统中的常见肿瘤，甲状腺肿瘤发病率逐年攀升，严重影响居民的身心健康[1-3]。如何提高甲状腺肿瘤诊断的准确性，识别肿瘤复发转移的风险是临床医生迫切需要思考的问题。随着分子诊断学的发展，DNA甲基化已成为表观遗传学的重要研究机制，在肿瘤形成发展中起到了非常重要的调节作用[4-5]。SLC5A8基因于2002年在甲状腺中首次被发现，存在于人类染色体的12q13-23，相关研究已证实其有促进肿瘤凋亡和抗肿瘤细胞增殖的作用[6-8]。SLC5A8基因在多种肿瘤组织中呈异常表达状态，大量研究分析发现，人类大部分肿瘤中均有SLC5A8 基因，例如甲状腺癌[9]、食管癌[10]、宫颈癌[11]等。目前关于SLC5A8基因甲基化检测对于甲状腺肿瘤的良恶性的早期诊断的研究不多，同时针对甲状腺肿瘤恶变监测及预后评估尚未见相关报道。本研究采用回顾性方法，探讨SLC5A8基因甲基化在甲状腺肿瘤的诊断及预后中的意义。
1.1 一般资料
收集2017年10月至2019年9月在本院行初次甲状腺手术的患者，其中男126例，女274例，平均年龄(49.24±4.76)岁。切下新鲜样本，获取甲状腺病灶组织(甲状腺癌或甲状腺腺瘤)、癌旁组织(与肿瘤边缘的间距<0.5 cm)、正常甲状腺组织(简称正常组织，与肿瘤边缘的间距>2.0 cm，并经病理证实无癌)。不同病理类型标本各取100例，共计400例。100例甲状腺癌中有分化型甲状腺癌89例，其中乳头状癌83例，滤泡状癌6例；
未分化癌5例；
髓样癌6例。标本均由本院病理科给予确诊，切除后立刻放入液氮中保存。患者均签署知情同意书，符合医学伦理学规定。纳入标准：入组的所有病例均具备明确的手术适应证；
具有完整的临床资料、实验室检查结果、病理诊断资料；
所有患者否认甲状腺相关疾病临床治疗史，否认在接受手术治疗前有放化疗等抗癌治疗，否认合并其他类型恶性肿瘤及其他相关遗传病史；
年龄20～70周岁。排除标准：合并有其他甲状腺疾病者，或有其他类型恶性肿瘤病史。
1.2 临床资料
收集患者性别、年龄、结节数目、结节大小、是否侵犯包膜、甲状腺结合球蛋白(TG)、胆固醇、甘油三酯、术前甲状腺功能、B超特点(是否有钙化灶、边界是否清晰、是否有血流信号)、有无淋巴结转移、TNM分级等信息。临床资料以患者手术时的住院病例为依据。
1.3 信息随访
通过查阅门诊病历、住院病例、打电话形式对患者进行随访，随访时间自术后起至2021年9月，平均随访时间2年。记录患者最后随访日期及疾病状态(无事件、疾病持续、复发、疾病特异性死亡)，记录复发类型(局部复发、区域复发、远处复发)、复发日期等。
1.4 实验方法
1.4.1引物设计
应用引物设计软件Primer5并参照Gene Bank自行设计SLC5A8基因引物，交由上海生工生物有限公司协助合成，引物的序列详见表1。针对SLC5A8基因的DNA序列设计2对引物，进行PCR反应。
表1 引物的序列及扩增片段
1.4.2SLC5A8基因甲基化检测
采用甲基化特异性PCR(MSP)法检测，按照 DNA 提取试剂盒说明书步骤提取标本组织 DNA 并修饰，将对应引物进行亚硫酸氢盐修饰 DNA 样本的 PCR 扩增。PCR 反应条件：95 ℃预变性10 min；
95 ℃ 15 s；
58 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s，40次循环；
72 ℃延伸10 min。扩增完毕后，120 V 电泳30 min，电泳后对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳照相，甲基化引物扩增后有阳性条带者发生基因甲基化，未出现条带的结果为实验中的阴性对照。
1.4.3SLC5A8基因转录水平检测
采用RT-PCR 法检测SLC5A8基因mRNA转录情况，按照 RNA 提取试剂盒说明书步骤提取样本组织总RNA，随后进行反转录合成cDNA。采用荧光定量PCR试剂盒对cDNA进行PCR反应。PCR反应条件：95 ℃ 预变性5 min；
95 ℃15 s；
60 ℃ 40 s,72 ℃ 30 s,40次循环；
72 ℃延伸10 min。采集荧光信号PCR结束后，记录扩增循环数(CT值)。对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳照相。
1.5 统计学处理
2.1 组织中SLC5A8基因甲基化情况
400例标本中，4组间SLC5A8基因甲基化阳性率差异有统计学意义(χ2=130.765，P<0.001)。进一步两两比较显示，癌组织SLC5A8基因甲基化阳性率均显著高于腺瘤组织(χ2=4.23，P<0.05)、癌旁组织(χ2=64.98，P<0.05)和正常组织(χ2=90.51，P<0.05)；
腺瘤组织高于癌旁组织(χ2=29.28,P<0.05)和正常组织(χ2=61.28,P<0.05)。癌旁组织与正常组织比较差异无统计学意义(χ2=3.54，P>0.05)。见表2。
表2 SLC5A8基因甲基化阳性率分析[n(%),n=100]
2.2 组织中SLC5A8基因表达水平
对扩增循环数差值(△CT)进行统计分析，甲状腺癌组织、腺瘤组织、癌旁组织、正常组织SLC5A8基因表达水平分别为9.54±1.03、8.03±0.99、6.85±0.74、6.30±1.03，组间差异有统计学意义(F=6.324，P=0.033)。这表明SLC5A8基因在癌组织中表达水平较腺瘤组织、癌旁组织及正常组织明显降低。
2.3 SLC5A8甲基化与甲状腺肿瘤临床病理特征的关系
SLC5A8甲基化阳性组与阴性组比较，包膜侵犯、TG水平、胆固醇水平、甘油三酯水平、术前甲状腺功能及淋巴结转移差异有统计学意义(P<0.05)，而年龄、性别、结节数量、结节大小等差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。
表3 SLC5A8甲基化与临床特征的关系(n=200)
2.4 甲状腺肿瘤患者复发率分析
在2年的随访中，甲状腺癌组及甲状腺腺瘤组中分别有17例及21例患者失访，甲状腺腺癌组患者的复发率(13.25%，11/83)显著低于甲状腺腺瘤组(29.11% ，23/79)，差异有统计学意义(χ2=9.428，P<0.05)。进一步分析显示，SLC5A8甲基化阳性患者的复发率(25.67%，20/113)高于甲基化阴性患者(10.20%，5/49)，差异有统计学意义(χ2=4.936，P<0.001)。见图1。
2.5 甲状腺肿瘤预后分析
单因素分析显示，甲状腺肿瘤预后与SLC5A8甲基化、甲状腺结节数量、结节大小、包膜侵犯、TG水平、胆固醇水平、术前甲状腺功能、淋巴结转移有关。进一步通过Cox回归分析模型显示，SLC5A8甲基化、甲状腺结节数量、结节大小、包膜侵犯、TG水平、术前甲状腺功能、淋巴结转移及TNM分级为甲状腺肿瘤患者预后的影响因素(P<0.05)，见表4。
表4 甲状腺肿瘤预后单因素和多因素分析
续表4 甲状腺肿瘤预后单因素和多因素分析
A：甲状腺腺瘤于甲状腺癌患者复发情况比较；
B：SLC5A8基因甲基化阳性及阴性患者复发情况比较。
现今，甲状腺癌已成为内分泌系统最常见的恶性肿瘤，其发病率正在逐年升高[12-13]。鉴于目前对甲状腺肿瘤的过度诊断及其惰性生长的特性，不少学者反对开展甲状腺肿瘤的人群筛查，如何快速、准确诊断甲状腺肿瘤型别仍是当前的临床难点。目前，DNA甲基化异常已经成为判定肿瘤分子的特异性生物标志物，在肿瘤的早期诊断、预后判断上具有指导性作用[14-16]。既往研究表明，大部分肿瘤中都会发现SLC5A8 基因，其表达明显降低或缺失，例如甲状腺癌、食管癌[10]、乳腺癌[17]等。同时，SLC5A8基因能够和生物素起反应，可以抑制细胞癌变，杀死癌细胞，加快癌细胞凋亡速度。
本研究通过对不同甲状腺组织中SLC5A8基因甲基化的检测情况发现，其在癌组织及腺瘤组织中呈高表达状态，而其mRNA转录水平减弱，与张利红等[18]研究结果一致，表明SLC5A8基因甲基化在甲状腺肿瘤中普遍存在。因常规病理检查中存在潜隐性的可能，不能及时、准确地发现甲状腺组织恶变，而导致诊断的准确率有所差异，癌旁组织及正常组织中SLC5A8基因甲基化的检测，从分子水平上弥补了这一缺陷。
早期对甲状腺癌进行风险等级评定，对避免低危患者因不必要的过度治疗带来的不良反应和精准预测患者的预后情况都具有重要意义。经过为期2年的随访发现，甲状腺腺瘤及甲状腺癌的复发率分别为29.11%和13.25%，略高于国内相关研究(8.89%～23.53%)[19-21]，其原因在于本研究中行单侧切除术的患者较多，此外部分患者术后未行131I清扫，从而导致复发率升高。既往已有研究表明，DNA甲基化可用于结肠癌[22]、肝癌[16]的诊断与预后评测，本研究结果显示，SLC5A8基因甲基化与甲状腺肿瘤患者包膜侵犯、TG水平、胆固醇水平、甘油三酯含水平、术前甲状腺功能、淋巴结转移有关，差异有统计学意义(P<0.05)，而与年龄、性别、结节数量、结节大小等因素无关。随访发现，SLC5A8基因甲基化阳性患者术后2年复发率(25.67%)显著高于阴性患者(10.20%)，且与疾病分级相关。COX多因素分析结果显示，SLC5A8基因甲基化为影响甲状腺肿瘤患者预后的危险因素之一，与王晓辉等[9]的研究结果一致。
综上所述，通过对甲状腺肿瘤SLC5A8基因甲基化的检测，表明其在甲状腺肿瘤中普遍存在，可作为诊断、识别甲状腺肿瘤的辅助技术。同时，为进一步研究甲状腺肿瘤的发生发展及预后的表观遗传学变化机制提供了重要依据，并对甲状腺肿瘤的分子生物学治疗提供潜在帮助。
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