于玲
（福建省轻工业研究所有限公司，福建 福州 350005）
皮肤是人体最大的器官，作为人体抵御外界侵害的第一道防线，有着保护、调节、分泌、保湿、屏障等功能[1,2]。但皮肤长期暴露在具有各种危险因素，如紫外线（Ultraviolet，UV）、化学物等外界环境中，其功能可能会因这些外源性损伤导致受损，从而失去重要功能。长期UV暴露是诱发许多皮肤病的主要危险因素，可出现一系列病理生理学改变，包括炎症、氧化应激、DNA损伤等[3-6]，最终导致皮肤细胞损伤，甚至产生皮肤癌[7-9]。
硫氧还蛋白（Thioredoxin，TXN）系统是具有氧化还原活性的小分子蛋白系统，由硫氧还蛋白（TXN）、硫氧还蛋白还原酶（TXNRD）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）三部分组成，在氧化还原稳态中起着关键作用[10-12]。TXN系统中高活性的氧化还原位点（-Cys-X-X-Cys-)，可以有效地保护生物体免受氧化应激和损伤[13]。TXN系统参与了许多至关重要的细胞生物学过程，包括细胞代谢、分化、增殖和凋亡等[14]。作为维持机体氧化还原稳态的重要组成部分，如果TXN系统被破坏有可能引起健康问题，包括肿瘤、神经退行性疾病和心血管疾病等[15]。
福建酸竹是中国东南部分布最广的竹种之一，蛋白质含量高，钙、磷元素及纤维含量丰富。据报道，不同的竹来源制品可用于治疗多种疾病，包括炎症性疾病、消化系统疾病、循环系统疾病、糖尿病等代谢紊乱性疾病[16-19]，最新研究表明，韩国传统食品竹盐具有一定的抗炎活性。在2,4-二硝基氟苯诱发的特应性皮炎模型中，竹盐可显著降低小鼠的血清中瘙痒相关因子的水平，同时减少了炎症细胞的浸润[20]，然而BEX在UV诱导的皮肤疾病中的作用还尚不明确，特别是在皮肤光损伤中的作用研究也较为有限。
本研究通过检测BEX对UVB导致的细胞死亡、凋亡水平及氧化应激水平，并通过蛋白印迹实验等一系列手段，在细胞水平上进一步探索并验证BEX在保护UVB诱导皮肤光损伤中的潜在作用机制。
1.1 药品和试剂
本研究中使用的化学物质和试剂BEX购自福州百泰生物技术有限公司。
用天平称量适量BEX干粉剂，溶于蒸馏水中，然后用无菌 0.22 μm 注射过滤器过滤后，制得相应浓度的BEX（10、30、100、300 μg/mL）溶液，-20 ℃保存待用。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养和紫外线辐射
原代人皮肤角质形成细胞在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素/谷氨酰胺的杜氏改良Eagle培养基（Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）中培养，保存于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。UV辐射设备和步骤参照文献[21]～[25]。
1.2.2 抗体和试剂
Cleaved caspase 3 （#9661，1∶1000）、β-肌动蛋白（#3700，1∶3000）、硫氧还蛋白1（#2429，1∶1000）、硫氧还蛋白2（#14,907，1∶1000）、硫氧还蛋白还原酶1（#15,140，1∶1000）、硫氧还蛋白还原酶2（#12,029，1∶1000）购自Cell Signaling T ec hn ol o g y；
种属特异性二抗购自L I-C O R Biosciences。
1.2.3 细胞活力测定
使用细胞计数试剂盒-8（Dojindo，日本）检测细胞活力，将2×105个细胞/孔种于96孔板，培养基100 μL。
1.2.4 蛋白印迹法
样品在变性的8%～12% SDS-PAGE凝胶（Bio-Rad）上电泳，然后通过电印迹转移到聚偏氟乙烯膜上。在室温下用封闭缓冲液封闭1 h，一抗在4 ℃下孵育过夜，第二天将封闭好的膜与特定的二抗在室温下孵育1 h，用ECL试剂检测，β-actin为内参。
1.2.5 细胞凋亡试验
通过TUNEL百分比（TUNEL/Hoechst 33,342×100%）测定细胞凋亡率，通过细胞凋亡ELISA检测试剂盒（Roche，Palo Alto，CA）检测细胞凋亡。
1.2.6 活性氧检测
细胞经DCFH-DA处理，每隔5 min混匀一次，使其充分作用，其与细胞内的ROS反应并导致荧光变化。通过流式细胞仪分析定量处理后细胞中荧光的变化，从而检测细胞ROS的含量。
1.2.7 细胞转染
混合稀释的shRNA和稀释的Lipofectamine 2000，使其制成复合物，在室温孵育20 min。直接将复合物加入到每孔细胞中，摇动培养板，轻轻混匀。在37 ℃，5%CO2培养箱中培养约4～6 h，将孔内含有shRNA-Lipofectamine 2000复合物的培养基移去，更换新鲜培养基。转染完成后24～72 h内可进行shRNA效果监测。
1.2.8 TXN 和TXNRD活性测定法
按分组处理细胞后培养24 h。用胰蛋白酶消化细胞，用PBS洗2次，然后在TE缓冲液中进行超声处理，随后测量蛋白浓度。按TXN活性荧光检测试剂盒（瑞士IMCO）和TXNRD检测试剂盒（美国Sigma公司）公司的方法说明，对总蛋白（20μg）进行TXN和TXNRD活性评估。
1.2.9 统计分析
各独立实验至少重复3次，分析数据采用平均值±SEM表示，所有数据采用GraphPad Prism 7.0进行数据统计分析，P＜0.05时认为具有统计学意义。
2.1 酸竹提取物对UVB诱导的皮肤光损伤具有保护作用
为了明确BEX在UVB对原代人角质形成细胞活性损伤的保护作用，我们使用BEX（100μg/mL）预处理原代人角质形成细胞30 min后，首先用不同剂量强度的UVB（5、10、15、20、25 mJ/cm2）照射原代人角质形成细胞后，在完全培养基中培养24 h。CCK8实验结果（图1A）表明，UVB照射可诱导原代人角质形成细胞的死亡，而上述现象可被BEX（100 μg/mL）预处理抑制。进一步的实验表明，BEX在原代人角质形成细胞中表现出剂量依赖的抗UVB活性（图1B），同时，发现用100 μg/mL的BEX预处理细胞表现出良好的抗UVB活性，接下来我们选择该浓度用于后续研究。
接下来应用western blot检测cleaved caspase-3水平分析原代人角质形成细胞中的细胞凋亡水平。结果表明，UVB（20 mJ/cm2）照射后cleaved caspase-3蛋白表达水平增高，而用BEX（100 μg/mL）预处理后蛋白表达水平可显著降低（图1C和D）。TUNEL测定检测结果表明，UVB（20 mJ/cm2）照射后凋亡细胞数显著增加，而经BEX（100 μg/mL）预处理后可显著降低细胞凋亡数（图1E）。流式细胞术检测发现在原代人角质形成细胞中，UVB（20 mJ/cm2）照射引起了显著的ROS产生，而BEX（100 μg/mL）预处理极大减少了这种效应（图1F）。
图1 BEX保护人皮肤角质形成细胞免受紫外线照射
2.2 BEX 调节原代人角质形成细胞中TXN1水平
TXN 系统是许多生理过程的基础，包括细胞增殖和凋亡[26]，首先检测BEX在TXN系统中对UVB照射的原代人角质形成细胞的影响。TXN活性检测和TXNRD活性检测结果表明，经UVB（20 mJ/cm2）照射后，原代人角质形成细胞的TXN和TXNRD活性显著降低（图2A和图2B）。此外，BEX（100 μ g/mL）预处理则极大减弱了这种效应，表明BEX可以有效抑制UVB照射诱导的原代人角质形成细胞的TXN和TXNRD活性水平下降现象。
接着应用western blot检测蛋白TXN1、TXN2、TXNRD1和TXNRD2的表达水平（图2C和图2D）。Western blot检测结果表明，TXN1蛋白表达水平通过BEX（100 μg/mL）处理显著升高，而TXN2、TXNRD1和TXNRD2的蛋白表达水平与对照组相比无明显变化，表明TXN1在BEX的细胞保护功能中起关键作用。
图2 BEX通过调节TXN1介导UVB照射诱导原代人角质形成细胞损伤的保护作用
2.3 TXN1 敲低减弱BEX介导的UVB诱导的原代人角质形成细胞的保护功能
为了研究TXN1在BEX介导的原代人角质形成细胞保护的作用，我们使用NTC或TXN1 shRNA转染的原代人角质形成细胞进行实验。如图3A所示，TXN1敲低显著降低了BEX（100 μg/mL）预处理组的细胞活力，但它不能完全阻断BEX的保护功能，表明BEX可能有其他机制来调节UVB诱导的皮肤细胞死亡。组蛋白-DNA ELISA测定的数据表明，当TXN1被敲低时，BEX（100 μg/mL）预处理，不能减少UVB（20 mJ/cm2）照射诱导的细胞凋亡（图3B）。以上这些结果表明TXN1对BEX介导的原代人角质形成细胞对UVB的细胞保护至关重要。
图 3 TXN1对BEX介导的原代人角质形成细胞的光损伤作用
TXN 系统参与了BEX介导的原代人角质形成细胞的保护作用，BEX通过调节TXN1介导UVB照射诱导原代人角质形成细胞损伤的保护作用。这些实验结果表明BEX在对抗皮肤光损伤中的具有良好的应用前景，为预防或缓解光老化和其他UV引起的皮肤病提供一种潜在治疗试剂，并为研发新型皮肤抗光老化产品提供研究基础及理论依据。
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