李靖云，孙辉，曾蒲军，王银红△
（1.湖南省药品检验检测研究院，湖南 长沙 410001；
2.湖南省药品质量评价工程技术研究中心，湖南 长沙 410001；
3.湖南省药品审核查验中心，湖南 长沙 410001）
枇杷止咳颗粒由枇杷叶、罂粟壳、百部、白前、桑白皮、桔梗、薄荷脑组成，可用于止嗽化痰及治疗痰热壅肺所致咳嗽、咯痰及支气管炎见上述症候者，方中薄荷脑为佐药，具有祛风利咽功效。2020年版《中国药典（一部）》［1］收载的该制剂质检方法为薄层色谱（TLC）法。研究显示，气相色谱（GC）法常用于其含量测定［2-5］。考虑到制剂中薄荷脑的制备工艺（用少量乙醇溶解后喷入，混匀，制粒）及其挥发性，TLC法不能全面反映药品中薄荷脑的实际质量可能存在较大误差［6-7］，为此，本研究中采用GC测定不同企业枇杷止咳颗粒中薄荷脑含量，为优化薄荷脑的质量控制提供参考。现报道如下。
1.1 仪器
Agilent 8890型气相色谱系统、氢火焰离子化（FID）检测器（安捷伦科技有限公司）；
KQ-500DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
Mettler AE240型、Mettler Toledo XSE 205DU型电子分析天平［梅特勒托利多科技（中国）有限公司］。
1.2 试药
枇杷止咳颗粒（企业A，批号记为S1，S2；
企业B，批号记为S3，S4；
企业C，批号记为S5，S6；
企业D，批号记为S7，S8；
企业E，批号记为S9）。薄荷脑对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110728-201707，含量99.8%）；
萘对照品（分析纯，天津市光复精细化工研究所，批号为20190811）；
无水乙醇为分析纯，水为纯化水。
2.1 色谱条件
色谱柱：DB-WAX毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25μm）；
载气：高纯度氮气；
柱温：120℃；
进样口温度：250℃；
检测器：FID；
检测器温度：250℃；
空气流速：400 mL/min；
氢气流速：30 mL/min；
流速：3 mL/min；
分流比：10∶1；
进样量：1μL。
2.2 溶液制备
内标溶液：取萘对照品52.98 mg，精密称定，置500 mL容量瓶中，加入无水乙醇溶解，定容，摇匀，即得。
对照品溶液：取薄荷脑对照品52.45 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加入无水乙醇溶解，定容，摇匀，即得对照品溶液Ⅰ；
精密量取10 mL，置50 mL容量瓶中，加入无水乙醇定容，摇匀，精密量取25 mL，加入内标溶液5 mL，置50 mL容量瓶中，加入无水乙醇振摇溶解，定容，摇匀，即得对照品溶液Ⅱ。精密量取对照品溶液Ⅰ2 mL，置100 mL容量瓶中，加无水乙醇定容，摇匀，精密量取20 mL，加入内标溶液20 mL，置200 mL容量瓶中，加入无水乙醇溶解、定容，即得对照品溶液Ⅲ。
供试品溶液：取样品内容物适量，研细，取3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入含2 mL内标溶液的无水乙醇20 mL，称定质量，冰浴超声（功率500 W，频率40 kHz；
下同）处理20 min，放至室温，再次称定质量，加无水乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
阴性对照品溶液：按枇杷止咳颗粒处方及工艺制备缺薄荷脑的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。
2.3 方法学考察
系统适用性试验：取2.2项下对照品溶液Ⅱ、供试品溶液和阴性对照品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果薄荷脑与其他物质均能达到基线分离，理论板数按薄荷脑峰计应不低于10 000，且阴性对照无干扰。详见图1。
图1 气相色谱图1.Menthol 2.NaphthaleneA.Reference solutionⅡB.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 GC chromatograms
线性关系考察：精密吸取0.01，0.05，0.20，0.50，1.00，2.00 mL对照品溶液Ⅰ，及内标溶液1 mL共6份，置10 mL容量瓶中，加入无水乙醇溶解、定容、摇匀，制成质量浓度分别1.05×10-3，5.23×10-3，2.09×10-2，5.23×10-2，0.105，0.209 mg/mL的系列对照品溶液；
分别取1μL，按2.1项下色谱条件进样测定，以薄荷脑质量浓度（X，mg/mL）为横坐标、对照品峰面积/萘峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=7.626 8X+0.002 4（R2=1）。结果表明，薄荷脑质量浓度在1.05×10-3～0.209 mg/mL范围内与对照品峰面积/萘峰面积线性关系良好。
精密度试验：精密吸取对照品溶液Ⅱ适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录相对响应值。结果薄荷脑峰面积的RSD为0.51%（n=6），表明仪器精密度良好。
重复性试验：取同一批样品适量，精密称定，共6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录相对响应值并计算含量。结果薄荷脑平均含量为0.083 mg/g，RSD为0.98%（n=6），表明方法重复性良好。
稳定性试验：取同一供试品溶液适量，分别于室温下放置0，6，12，18，24 h时，按2.1项下色谱条件进样测定，记录相对响应值。结果薄荷脑峰面积的RSD为0.68%（n=5），表明供试品溶液室温下放置24 h内基本稳定。
加样回收试验：取已知含量的样品内容物适量，研细，取1.5 g，精密称定，共6份，各加入20 mL 2.2项下对照品溶液Ⅲ，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录相对响应值并计算加样回收率，结果见表1。
表1 加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）
2.4 样品含量测定
取5家企业9批样品各适量，分别按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录相对响应值并计算薄荷脑含量，结果见表2。
表2 样品含量测定结果（mg/袋，n=2）Tab.2 Results of the content determination of menthol in the samples（mg/bag，n=2）
3.1 试验条件考察
薄荷脑为易挥发物质，故提取时不考虑因温度过高而易造成损失的索式提取、回流提取等方法，而选择冰浴超声提取方法。超声时间分别考察10，20，30 min，结果表明，超声10 min提取基本完全，故选择中间值20 min作为提取时间。提取溶剂比较了石油醚（60～90℃）、乙酸乙酯和无水乙醇，以无水乙醇的提取率最高，故选择。同时对提取体积（10，15，20 mL）进行了考察，结果发现，取样品细粉约3 g时，10 mL与20 mL的提取率基本相当，为保证提取完全，提取体积选择20 mL。
3.2 样品含量测定结果分析
本研究结果表明，同一企业（即使不同批次）样品含量差异较小，不同企业之间差异较大（最高含量约为最低含量的2倍）。考虑到薄荷脑具挥发性、沸点低、室温易升华的特点，其可能吸附在包装袋内表面［8］。按本研究中拟订方法和色谱条件，随机抽取各企业各批样品，均6袋，分别对包装袋上及样品内容物中的薄荷脑含量进行考察。根据吸附量可将企业分为3类。Ⅰ类，企业C，D；
Ⅱ类，企业A，B；
Ⅲ类，企业E；
薄荷脑吸附量分别为＜10%，20%～30%，≈50%。
3.3 方法评价
本研究中所建方法简单可行、重现性好、准确可靠，可用于测定枇杷止咳颗粒中薄荷脑含量。但发现颗粒剂的包装袋上会吸附薄荷脑。查看各生产企业的包装均为复合膜，包装材料无明显差异，推测可能是由于薄荷脑的喷入工艺导致其包裹于颗粒表面，在储存过程中挥发后吸附于包装袋上［8-9］，从而导致颗粒中薄荷脑含量减少。建议生产企业考察药用包装袋对薄荷脑的吸附作用，通过改良生产工艺，改善储存温湿度或更换吸附性较小的包装材料等方式，减少薄荷脑的损失。
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