邵一鸣，张濛，连鸿凯，张新安，何姣
1.郑州大学附属郑州中心医院，河南 郑州 450001；
2.河南省人民医院，河南 郑州 450003；
3.漯河市郾城区中医院，河南 漯河 462300
骨质疏松症(osteoporosis)是一种全身性代谢性骨病，其特征是骨量和韧性下降、骨微结构破坏以及骨脆性增加[1]。随着人口老龄化的加剧，骨质疏松症患者数量不断增加。骨质疏松症的严重后果为发生脆性骨折，从而导致残疾率和死亡率增加[2]，尽早采取科学的预防策略和规范治疗有着重要意义。目前，以促进骨形成和抑制骨吸收为特点的两大类药物被广泛用于治疗骨质疏松症[3]，但同时也存在一系列副作用，包括中风、心血管疾病、胃肠不适及肾损伤等[4]。因此，期待能够寻找到疗效更加显著、安全性更高的抗骨质疏松药物为其临床治疗提供更多选择。
长久以来，中药一直被用于骨质疏松症患者的补充和替代治疗，在治疗骨质疏松症中起着不可估量的作用。黄精是百合科植物滇黄精、黄精和多花黄精的干燥根茎，味甘、平，无毒，具有补气养阴、健脾润肺、益肾等功效，可用于脾胃虚弱、体倦乏力、口干食少、肺虚燥咳、精血不足、内热消渴等症[5]。已有研究证明，黄精中的多糖类物质可以逆转骨质流失并预防骨质疏松症[6]。但是，由于中药多成分、多靶点、多途径的特点，其确切的作用机制有待探索。近年来，网络药理学的广泛应用为研究人员提供了新的方向和策略来阐明中药治疗疾病的作用机制。基于此，本研究利用网络药理学方法探讨黄精治疗骨质疏松症的有效成分、关键靶点和相关途径，为今后骨质疏松症的临床治疗和深入研究提供方向和思路。
1.1 黄精活性成分筛选及相关靶点获取采用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https：//tcmsp-e.com/)筛选黄精的活性成分。将药代动力学参数作为中药活性成分的筛选条件，设置口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%及类药性(drug-likeness，DL)≥0.18，筛选出药物的活性成分，并提取药物活性成分的相关靶点。
1.2 骨质疏松症相关靶点的获取使用GeneCards(https：//www.genecards.org/)数据库和在线人类孟德尔遗传(online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//omim.org/)数据库，以“osteoporosis”为关键词进行检索，得到骨质疏松症的相关靶点。
1.3 黄精治疗骨质疏松症的潜在靶点的获取使用在线软件VENNY2.1(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)对骨质疏松症相关靶点和黄精活性成分相关靶点进行分析，取交集得到黄精治疗骨质疏松症的潜在作用靶点，并绘制韦恩图。
1.4 蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络的构建和核心靶点筛选将黄精治疗骨质疏松症的潜在作用靶点导入STRING在线数据库(http：//string-db.org/)，设置置信度≥0.4，隐藏游离靶点，构建潜在靶点PPI网络。将PPI网络数据导入Cytoscape 3.8.2软件进行拓扑分析，并利用Cytohubba插件根据网络中节点的度值筛选核心靶点。
1.5 “黄精-活性成分-潜在靶点”网络的构建为清晰呈现出黄精中有效成分与潜在靶点之间的对应关系，采用Cytoscape 3.8.2软件构建“黄精-活性成分-潜在靶点”对应关系网络，并进行拓扑分析，网络中节点度值越大，表明该有效成分发挥的作用越大。
1.6 基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信号通路富集分析将潜在靶点提交至DAVID在线数据库进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，得到黄精治疗骨质疏松症的主要生物学功能和信号通路。
1.7 分子对接在Pubchem在线数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载节点度值靠前的有效成分的3D结构，从PDB数据库(https：//www.rcsb.org/)下载PPI网络中节点度值靠前的靶点的PDB格式文件，最后使用schrodinger软件进行分子对接。
2.1 黄精活性成分及相关靶点通过TCMSP数据库检索获得黄精化学成分38个，根据OB≥30%及DL≥0.18筛选得到活性成分12个，剔除无对应靶点信息的3个活性成分，共获得黄精活性成分9个及相关靶点86个。见表1。
表1 黄精活性成分信息表
2.2 骨质疏松症疾病靶点及黄精治疗骨质疏松症的潜在靶点通过GeneCards数据库筛选获得骨质疏松症相关靶点4 449个，OMIM数据库获得骨质疏松症相关靶点136个，合并去重后共获得疾病靶点4 490个。使用在线软件VENNY2.1对骨质疏松症相关靶点和黄精活性成分相关靶点进行映射，取交集后，获得59个交集靶点，即为黄精治疗骨质疏松症的潜在作用靶点。见图1。
图1 黄精活性成分相关靶点与骨质疏松症相关靶点韦恩图
2.3 PPI网络及核心靶点将黄精治疗骨质疏松症的潜在作用靶点导入STRING在线数据库构建潜在靶点PPI网络。该PPI网络包含59个蛋白质节点，488条边。将PPI网络数据导入Cytoscape 3.8.2软件进行拓扑分析，并利用Cytohubba插件筛选出该网络中节点度值排名前10位的核心靶点，分别是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase 1，AKT1)、肿瘤抗原p53(tumor protein p53，TP53)、转录因子AP-1(AP-1 transcription factor subunit，JUN)、丝裂原活化蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteme aspartate specific protease 3，CASP3)、雄激素受体(androgen receptor，AR)、雌激素受体1(estrogen receptor 1，ESR1)、基质金属蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)、前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)。采用STRING在线数据库构建核心靶点PPI网络。见图2、图3。
图2 黄精治疗骨质疏松症的潜在靶点PPI网络图
注：节点大小和颜色与相互作用程度成正比图3 黄精治疗骨质疏松症的核心靶点PPI网络图
2.4 “黄精-活性成分-潜在靶点”网络图采用 Cytoscape 3.8.2 软件构建“黄精-活性成分-潜在靶点”网络，图中红色节点代表黄精，蓝色节点代表黄精的有效成分(隐藏游离靶点后，剔除没有对应靶点的活性成分)，黑色节点代表黄精治疗骨质疏松症的潜在靶点。网络拓扑分析发现，度值排名靠前的有效成分分别是黄芩素(节点度值为28)、β-谷甾醇(节点度值为23)。见图4。
图4 “黄精-活性成分-潜在靶点”网络图
2.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析通过DAVID 在线工具对潜在靶点进行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析。GO功能富集分析得到298个生物过程(biological process，BP)，31个细胞组分(cellular component，CC)及73个分子功能(molecular function，MF)，其中BP主要涉及葡萄糖输入的正向调节(positive regulation of glucose import)、组织内细胞数量稳态(homeostasis of number of cells within a tissues)、对有机物的反应(response to organic substance)等；
CC主要涉及树突细胞质(dendrite cytoplasm)、细胞膜(membrane)、髓鞘(myelin sheath)等；
MF主要涉及核因子-kappa B结合[(nuclear factor-kappa B，NF-κB)binding]、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性(protein serine/threonine/tyrosine kinase activity)、激活转录因子结合(activating transcription factor binding)等。将结果分别按照P值排序，使用微生信绘制出前10个结果的气泡图。见图5。KEGG信号通路富集分析获得85条信号通路，主要涉及癌症相关通路(pathways in cancer)、细胞凋亡(apoptosis)、p53信号通路(p53 signaling pathway)、破骨细胞分化(osteoclast differentiation)、雌激素信号通路(estrogen signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路[(tumor necrosis factor，TNF) signaling pathway]等。结果表明，黄精中多种有效成分可以通过多条不同信号通路作用于骨质疏松症。选取P值前15的信号通路绘制气泡图。见图6。
图5 GO功能富集分析
2.6 分子对接结果配体与受体结合能量越低，其结合构象越稳定，相互作用的可能性越大。当结合能<-5.0 kcal·mol-1时，两者具有良好的亲和力。分子对接结果显示，黄芩素和β-谷甾醇与关键靶点AKT1、TP53的结合能均<-5.0 kcal·mol-1，提示它们之间具有良好的结合力。见表2，图7。
表2 黄精主要活性成分与关键靶点的结合能 (kcal·mol-1)
注：气泡大小与通路中所含靶点基因数量成正比图6 KEGG信号通路富集分析
注：A：黄芩素-AKT1；
B：β-谷甾醇-AKT1；
C：黄芩素-TP53；
D：β-谷甾醇-TP53图7 活性成分与核心靶点的分子对接模式图
数千年来，中药一直以多成分、多靶点的方式用于预防和治疗各种疾病，其在治疗骨代谢相关疾病中更是处于举足轻重的地位。黄精具有降血糖、 降血脂、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗菌、抗病毒、增强免疫等多种药理作用[7]。实验证明，黄精中的黄精多糖可通过调控骨修复及骨代谢因子进而提高骨质疏松症骨折大鼠生物力学性能及骨密度[8]。因此，本研究采用网络药理学和分子对接方法探索黄精的活性化合物及其治疗骨质疏松症的潜在分子机制。
基于TCMSP数据库筛选得到黄精治疗骨质疏松症的有效化学成分包括黄芩素、β-谷甾醇、薯蓣皂苷元等。通过构建“黄精-活性成分-潜在靶点”网络显示，黄芩素可能在治疗骨质疏松症中发挥重要作用。黄芩素是一种黄酮类化合物，可阻断NF-κB配体受体激活剂(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)通路诱导的信号分子从而抑制破骨细胞分化和成熟破骨细胞凋亡[9]。黄芩素还可通过MAPK/NF-κB/AP-1信号通路刺激成骨细胞分化[10]，通过激活NF-κB来触发成骨细胞分化，进而诱导MAPK和NF-κB的激活来加速分化过程；
在分化后期，黄芩素诱导MAPK和其他转录因子如AP-1和活化T细胞核因子蛋白c1 (nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1)的激活进一步诱导成骨分化。除此之外，黄芩素还可以通过抑制AKT促进叉头框蛋白(forkhead box other 1，FOXO1)的表达从而改善糖皮质激素诱导的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞成骨分化[11]。黄芩素具有成骨和破骨的双向调节作用，在改善骨代谢平衡及治疗骨质疏松症方面具有广泛应用前景。
通过PPI网络分析，本研究得到黄精治疗骨质疏松症的核心靶点有AKT1、TP53、JUN、FOS、CASP3、MMP9、ESR1、MAPK14、PTGS2、AR等。AP-1 在骨骼系统中起到重要的作用，由FOS、JUN和激活转录因子(activating transcription factor，ATF)蛋白家族成员组成，与成骨细胞和破骨细胞的增殖、分化和凋亡有着密切的关系[12-13]。研究发现，缺乏FOS、JUN的小鼠由于成骨细胞和破骨细胞缺陷导致骨量减少[14-15]。因此，FOS、JUN蛋白作为骨形成过程中的关键调节因子，可被用来开发作为治疗低骨量疾病的药物。AKT1是一种人类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与调节包括新陈代谢、增殖、细胞存活和血管生成在内的许多生理过程[16]。同时，AKT1也是成骨细胞和破骨细胞分化和功能调节的因子，可以介导成骨细胞和破骨细胞前体之间的耦合[17]。AKT1还可以通过磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)通路被激活，PI3K-AKT信号通路是软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞和脂肪细胞等骨骼成分细胞分化的关键途径[18]。体内外研究均表明，PI3K-AKT信号通路可以促进成骨细胞增殖、分化和骨形成抑制骨质疏松[19]。
在KEGG通路富集分析中，细胞凋亡信号通路、破骨细胞分化信号通路、p53信号通路、雌激素信号通路、TNF信号通路是黄精活性成分治疗骨质疏松症的重要信号通路。成骨细胞和破骨细胞来源于骨髓原始多能干细胞，分别在骨形成和骨吸收中发挥重要作用[20-21]。骨形成和骨吸收之间的平衡可以维持骨重塑和骨量。此外，骨微环境中的各种细胞因子作用于成骨细胞和破骨细胞的调节，促进骨重塑[22]。TNF-α由T淋巴细胞产生，通过抑制成骨细胞中碱性磷酸酶在抑制骨形成和矿化中起着至关重要的作用[23]。TNF-α可以刺激破骨细胞前体的形成并促进RANKL表达，从而影响骨吸收[24]，还可通过MAPK信号通路抑制成骨细胞分化[25]。这些证据都表明TNF-α抑制剂可能是有效预防或逆转骨丢失的潜在治疗靶点。p53由肿瘤抑制基因TP53编码，通过减缓细胞生长和分裂来抑制肿瘤生长[26]。研究发现，骨质疏松症患者血清p53水平升高并通过miRNA信号通路影响MSCs的功能来抑制成骨，敲低 p53 可部分逆转骨密度降低[27-28]。雌激素是骨代谢的重要调节剂，通过骨衬细胞中RANKL的靶向表达控制骨转换[29]。研究表明，OVX大鼠模型中雌激素缺乏会增加皮质骨的血管孔隙率，减少骨体积分数和小梁数量，并增强胫骨近端的骨小梁分离，降低骨强度[30]。值得一提的是，本研究所得到的靶点基因和信号通路相互验证，环环相扣，进一步说明黄精的活性成分可能通过增强成骨细胞分化和骨形成同时限制破骨细胞发育和骨吸收治疗骨质疏松症。
分子对接结果显示，黄芩素、β-谷甾醇与AKT1、TP53的对接结合力均<-5 kcal·mol-1，说明黄精活性成分与骨质疏松症相关靶点能够产生较好的蛋白结合活性。
综上所述，本研究利用网络药理学方法较为全面地分析了黄精治疗骨质疏松症的作用机制发现，黄精作用于骨质疏松症的方式是多通路、多靶点及多有效成分的，为今后的研究提供了参考和数据支持，但该研究结果还需要进一步的实验研究加以验证。
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