胡施祺， 戴德江， 罗金燕， 朱洁， 安千里， 李斌*
(1.浙江大学 生物技术研究所，浙江 杭州 310058；
2.浙江省植保检疫与农药管理总站，浙江 杭州 310020；
3.上海市农技推广中心， 上海 201103；
4.温州市植物保护与土壤肥料管理站，浙江 温州 325000)
猕猴桃细菌性溃疡病最早于20世纪80年代在美国加利福尼亚州[1]和日本神州静冈县[2-3]被发现，目前在美国、日本、法国、新西兰、韩国、伊朗、意大利、葡萄牙和智利等国家以及中国陕西、安徽、重庆、四川、湖北、湖南、河南和河北等地区均有发生，具有扩展快、危害重、防治难等特点，严重影响猕猴桃的产量及果实质量，给世界猕猴桃产业造成了严重的经济损失[4]。中国、美国、新西兰等国以及欧洲植物保护组织都已将猕猴桃细菌性溃疡病菌列为植物检疫对象和A2类检疫性有害生物[5]。丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)被认为是引起猕猴桃细菌性溃疡病的主要病原菌，该病原菌能够侵染猕猴桃属的多种寄主，包括美味猕猴桃、中华猕猴桃、软枣猕猴桃及狗枣猕猴桃[6]，引起叶斑叶枯、枝干枯裂溃烂、花器萎蔫坏死、皮孔变红，病处伴随菌脓分泌等症状[7]，造成树体死亡、果皮变厚、果味变酸、果实变小、果形不一。该病菌的远距离传播主要通过进出口的苗木、接穗及花粉等[8]。
为有效遏制猕猴桃细菌性溃疡病在我国的快速蔓延，建立其主要病原菌的快速、准确、灵敏和方便的检测方法至关重要。本文综述了国内外学者对猕猴桃细菌性溃疡病菌多样性及检测技术的研究进展情况，重点分析和比较了各类检测技术的优劣，为早期有效预防猕猴桃细菌性溃疡病提供了借鉴。
1.1 病原菌的确定
1983年，Opgenorth[1]在美国加利福尼亚州首次发现了猕猴桃细菌性溃疡病，通过生物学鉴定认为引起该病害的病原为丁香假单胞杆菌。1989年，Serizawa等[2-3]根据形态学、生理生化及致病性试验发现，1984年在日本静冈暴发的猕猴桃细菌性溃疡病病原菌与丁香假单胞杆菌死李致病变种(Pseudomonassyringaepv.morsprunorum，Psm)及丁香假单胞杆菌丁香致病种(Pseudomonassyringaepv.syringae，Pss)虽相似但存在明显差异，死李致病变种对梨和日本杏有弱致病性，而对其他24种植株均无致病性，据此认为该猕猴桃细菌性溃疡病病原菌是丁香假单胞杆菌属新的致病种，并将其命名为丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Psa)。1993年，朱晓湘等[9]通过生物学方法将我国1986年东山峰农场发生的猕猴桃细菌性溃疡病的病原菌鉴定为Pss，但随后意大利[10]、韩国[11]、法国、西班牙[12]、土耳其[13]、斯洛文尼亚[14]、新西兰[15]及希腊[16]等国的猕猴桃细菌性溃疡病的病原菌被鉴定为Psa，国内陕西[17-18]、安徽[19]、福建[20]、四川[21]等多地猕猴桃细菌性溃疡病的病原菌均被鉴定为Psa。目前，对于猕猴桃细菌性溃疡病病原菌的鉴定虽还没有统一结果，但国内外研究人员普遍认为猕猴桃细菌性溃疡病的病原为Psa[21]。
1.2 遗传多样性
Psa菌群具有丰富的遗传多样性。2012年，Chapman等[22]利用管家基因、Ⅲ型效应基因和植物毒素基因的多位点序列分析发现，全球至少包括4个具有不同进化轨迹的Psa类群：第一类群Psa1分离自日本，1992年在意大利暴发的Psa，可产生菜豆菌毒素；
第二类群Psa2分离自韩国，这一类群均含有能产生冠菌素的质粒，但是不含有产菜豆菌毒素的基因簇[23]；
第三类群Psa3为分离自新西兰特普克地区、智利奥希金斯和毛勒地区、中国陕西省的病原菌，2008年以后在意大利暴发，该类群既不能产生菜豆菌毒素也不能产生冠菌素，具有强致病性，已在全球流行，也被称为Psa-V[7]；
第四类群Psa4为此前流行于维多利亚州和西澳大利亚州的Psa，同样该类群也不能产生菜豆菌毒素和冠菌素，并且比其他生物群毒力更弱，仅能引起叶斑而不会引起溃烂与枝条枯萎等其他症状，生理生化特征也与其他3个类群有明显差异，该类群可以在KB培养基上产生高强度绿色荧光并能水解七叶苷，第四类群与其他3个类群在柠檬酸合成酶编码基因(cts)的同源性也低于其他类群与丁香假单胞菌茶树致病种(Pseudomonassyringaepv.theae，Psth)的同源性[24]，现已被归为新变种P.syringaepv.actinidifoliorum(Psaf)[25]。2014年，Sawada等[26]在日本佐贺分离到猕猴桃细菌性溃疡病病原菌，通过形态特征、生理生化测定、分子检测、致病性实验及多位点序列分析鉴定，该病原菌为不同于其他4个类群的新类群，并将该类群命名为Psa5。第五类群目前仅在日本局部地区有报道，该类群与第二类群亲缘性较近，但其既不具有第二类群保守的冠菌素合成基因，也没有日本本土病原菌第一类群保守的菜豆菌毒素合成基因，与其他3个类群组成不同的是该类群基因组中含有45个Ⅲ型分泌效应器基因[27]。
猕猴桃细菌性溃疡病菌的经典鉴定主要包括田间病害症状观察和病菌的生物学测定等。田间可通过观察症状进行初步鉴定，主要症状为枝干病部溢出大量初为乳白色、后变红褐色的菌脓，上部枝条萎蔫死亡，叶片产生中间为褐色、边缘为黄色晕圈的近圆形病斑。生物学鉴定主要包括细菌的分离纯化、形态观察等细菌学性状及生理生化测定[5,9,28]。传统方法鉴定虽不需要昂贵的仪器设备，但费时费力，而且特异性不高，随着微生物鉴定方法的不断发展，免疫学和分子生物学等[29]方法也逐渐应用于猕猴桃溃疡病菌的检测。
免疫检测是利用抗原和抗体的特异性和灵敏性，定量或定性检测待测物的一种方法。2017年，Cimmino等[30]利用Psa胞外多糖制备抗血清；
2018年，Chen等[31]利用Psa3特异性效应蛋白hopz5制备了具有良好特异性的多克隆抗血清PAb∶hopz5，能够区分Psa3与亲缘关系较近的细菌，如丁香假单胞杆菌丁香致病种、茶树致病种和番茄致病种等；
2020年，郭丽倩[5]以猕猴桃细菌性溃疡病的致病菌株为免疫原，通过杂交瘤技术获得的3株抗猕猴桃细菌性溃疡病菌的单抗6C5、14H5和18A4，据此建立的ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测猕猴桃细菌性溃疡病菌的检测极限分别达到9.0×102和3.6×103mL-1。免疫学检测虽然快速灵敏，但对抗血清的质量要求较高。随着分子生物学技术的快速发展，基于PCR的一系列分子检测技术逐渐被建立起来，这些分子检测方法更便捷，特异性和灵敏性更高，逐渐成为检测猕猴桃细菌性溃疡病的主要方法。虽然针对Psa特异性片段建立的分子检测方法有诸多优点，但也存在一些应用推广的缺点(表1)，如需要购买昂贵的配套仪器设备，需要检测人员具备专业的检测技术知识等[21]。
表1 猕猴桃细菌性溃疡病菌主要检测方法优劣势比较
传统的检测技术由于检测周期长、操作繁琐、灵敏度低、特异性弱已越来越难以适应当前植物检疫工作的实际需要，基于PCR的分子检测技术以其快速、简便、特异性强和灵敏度高等优点在Psa检测方面得到了大力发展。2002年，Koh等[11]采用随机扩增多态性技术筛选出Psa特异性片段，并据此设计出引物对KNF/KNR，可以特异地从Psa中扩增出一条492 bp的条带，使快速、准确诊断由Psa引起的猕猴桃溃疡病成为可能(表2)。2003年，Jung等[32]基于冠菌素合成编码基因cfl设计了巢式PCR，能有效检测第二类群Psa2，其他3个类群因不能合成冠菌素均不能被检测[33]。2010年，Rees等[34]根据16S-23S rDNA转录间隔区设计两对引物对PsaF1/R2和PsaF3/R4，能分别从Psa特异扩增出一条280 bp和175 bp的条带，但值得注意的是，丁香假单胞杆菌丁香致病种、茶树致病种和番茄致病种均能产生假阳性，需辅助明胶液化和对胡芦巴碱的利用等其他试验加以区分[34-35]。
表2 已报道用于检测丁香假单胞猕猴桃致病变种的引物
为进一步提高Psa分子检测技术的特异性，2011年Gallelli[36]等根据avrD1基因和KN-PCR产物设计了AvrDdpx-F/AvrDdpx-F和KNF/KNR两对引物进行双重PCR，可直接快速检测疑似感染的猕猴桃叶片、花蕾、枝干及花粉组织，而无需进行组织分离和DNA提取，极大减少了检测步骤和时间[5]；
此外，Psth、Pto及Pss等丁香假单胞杆菌相近种均不能产生226 bp和492 bp这两条特异条带。2013年，Biondi[37]根据外膜蛋白P1编码基因ompP1设计了引物B1/B2，并以KNF/KNR为巢式引物进行巢式PCR，虽与其他PCR技术相比在一定程度上提升了反应的灵敏度和特异性，但和KN-PCR及RG-PCR一样不易区别Psa与Psth、Pto，需进一步通过RFLP分析来区分[37]。邵宝林等[38]通过RAPD分析获得一条1 300 bp左右的特异片段，然后通过克隆测序及软件设计将获得的RAPD标记转化为更为稳定可靠的序列特异扩增区域(Sequence characterized amplified region，SCAR)标记，设计并合成一对SCAR特异引物F7/R7，能特异地从Psa中扩增出一条约950 bp的条带，而Pss、Pto等相近菌株均未扩增出特异条带，与传统检测方法以及通用引物逐步筛选法相比，该方法具有更高准确度和灵敏度。周大祥等[39-40]将叠氮溴化乙锭、叠氮溴化丙锭与实时荧光定量相结合用于Psa检测，染料穿透死菌细胞膜从而有效区别活死菌，弥补了PCR的不足，但因染料较贵，导致检测成本较高，极大地制约了其广泛推广使用。
针对Psa的遗传多样性，国内外学者也开展了特定类群的检测研究。例如2014年，Gallelli等[41]为提高Psa-V的特异性分子检测水平，建立了一种基于EvaGreen化学染料和hrpW基因的实时荧光PCR检测法，可特异灵敏地从猕猴桃叶片、果实和树皮组织中检测出Psa-V。2016年，Fujikawa[27]基于第五类群特异序列设计了能有效区别Psa5和其他4个类群的特异性引物Con002F/R、Con034F/R、Con044F/和Con067F/R，PCR及电泳结果证明这4套引物对均能从Psa5扩增出单一条带。2017年，Ruinelli等[42]采用比较基因组学方法，利用已公开的Psa基因组数据，选择独特的靶区，建立了两种能够检测Psa的环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，PSA LAMP和PSA3 LAMP，可区分不同类群的Psa，PSA LAMP对除第四类群(低毒力菌株)的其他3个类群产生阳性结果，而PSA3 LAMP只特异性针对普遍流行的第三类群Psa3。两种LAMP检测方法均有强特异性，亲缘关系较近的Psth、Pto、Pss等丁香假单胞杆菌其他致病变种均不能产生阳性结果；
同时LAMP检测不仅能从无症状猕猴桃材料检出Psa，且相比普通PCR，无需昂贵设备，所需时间更短。2021年，王一波等[43]通过简化检测步骤，优化PSA3 LAMP反应体系，加入荧光染料SYBR Green I等使反应结果可视化，减少对仪器设备的依赖，有效发挥LAMP在田间广泛应用的潜力。
自猕猴桃细菌性溃疡病首次报道以来，该病害已快速向世界各国扩散流行。目前，我国猕猴桃主产区基本都有该病害的发生，严重制约了我国猕猴桃产业的健康发展。而该病害得以快速流行和暴发的其中一个重要因素就是缺乏对病原菌快速、准确和灵敏的检测方法，本文总结了现有的各种猕猴桃细菌性溃疡病菌检测方法，重点比较了各自的优缺点。展望未来，有必要在下面几个方面予以进一步加强：
首先，需要推动现有检测技术产品化。随着免疫技术的发展，胶体金试纸条在植物检疫中的利用已较成熟，目前我国已开发出多款可供基层使用的相应检测试纸条产品，国外也有猕猴桃细菌性溃疡病抗体制备的报道，但猕猴桃细菌性溃疡病相关免疫学试纸条仍待开发，以满足农户等非专业人员和设备简单的基层检疫部门大规模普筛等需求。相比于普通PCR、qPCR及RT-PCR，LAMP具有设备简单、反应时间短、结果可视化等特点[42]，克服了分子检测需要昂贵的配套设备、专业的仪器及专业的检测技术知识等缺点[21]，能较好满足田间对猕猴桃细菌性溃疡病检测需求。
其次，各检测方法有利有弊，应采取多种检测方法相结合以达到更好的检测效果。例如噬菌体不仅可以作为生物制剂有效防控猕猴桃细菌性溃疡病，还可以用于猕猴桃细菌性溃疡病菌的检测。噬菌体是一种特异性感染靶细菌的病毒，由于其寄主范围的特殊性，可用于特定植物病原细菌种类和菌系的鉴别、预测病菌的消长、检测种子苗木的带菌及病菌存活情况，在植物病害研究中具有重要的理论和实践意义[6]。2007年，雷庆等[44]以丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种为指示菌，从猕猴桃细菌性溃疡病病枝中首次分离到一株噬菌体。近几年，虽然国内外均有报道利用分离噬菌体生物防治猕猴桃细菌性溃疡病菌[45-49]，然而，噬菌体在猕猴桃溃疡病菌的检测以及区分其各类群的差异方面仍未见文献报道，迫切需要进一步加强相关领域的研究。
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