李娟娟 高惠英 张婷婷 尚莉丽 范春雪 康亚亚 罗 静 李小峰
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的以侵蚀性、对称性多关节炎为主要临床表现的慢性、全身性自身免疫性疾病。
虽然其发病机制尚不明确,但有研究表明,辅助性T 细胞17(T-helper 17 cell,Th17)和调节性T 细胞(regulatory T cell,Treg)失衡可能是RA 最直接、最重要的发病要素。
尤其,Treg细胞减少或功能异常导致免疫耐受缺陷可能是RA发病的关键因素之一[1]。
然而,导致Treg 细胞减少或Treg/Th17 平衡失调的始动因素尚不明确。
TLR7 样受体(Toll-like receptor 7,TLR7)是一种模式识别受体,可识别相应配体,从而激活TLR 信号通路,导致各种促炎介质的产生[2]。
其可通过调节Th17 和Treg,而参与多种自身免疫性疾病的发生、发展[2,3]。
Pin1 (peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1)是一种肽脯氨酰基顺反异构酶,其主要作用可介导并上调TLRs 信号的转导及活性,还可以增强NF-κB 的活性,从而促进疾病的发展[4]。
既往研究发现,RA 患者外周血Pin1 过表达,Th17 增高而Treg 降低[5]。
那么,RA 患者外周血中TLR7 表达与Pin1 表达相关性如何,又与Th17/Treg细胞是否具有相关性,尚未见报道。
本研究旨在通过检测RA 患者外周血TLR7 和Pin1 含量,分析TLR7与Pin1、Th17/Treg、部分细胞因子及疾病活动度的相关性,进一步探索RA 发病机制。
1.一般资料：选取2020年5月～2021年3月山西医科大学第二医院风湿免疫科住院部及门诊确诊的RA 患者92 例作为RA 组,其中男性25 例,患者平均年龄为60 ±8 岁,女性67 例,患者平均年龄为55 ±10 岁。
所有患者符合1987年ACR 修订的RA 分类标准,并排除其他关节炎、重叠其他风湿病、有严重感染、合并恶性肿瘤及其他严重心脑血管疾病者。
RA组又分为初发组和治疗组,其中初发组46 例(指确诊入组时尚未使用药物),治疗组46 例(指确诊入组时已使用药物,包括非甾体抗炎药、糖皮质激素和DMARDS 药物,其中糖皮质激素为小剂量醋酸泼尼松每日10mg 及以下,DMARDS 药物主要有甲氨蝶呤或来氟米特、联合羟氯喹或短期的生物制剂治疗,且治疗时间为3 ～6 个月)。
选择同期笔者医院的健康体检者40 例作为健康对照组。
本研究所有患者均签署知情同意书,并通过笔者医院医学伦理学委员会审批[伦理审批号：(2017)KY 第(004)号]。
2.试剂和检测方法：TLR7 与Pin1 试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。
采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunos orbent assay,ELISA)检测TLR7 与Pin1。
经前臂肘窝处取外周静脉血5ml 于肝素抗凝管中,颠倒混匀。
血清于1.5ml EP 管中,室温静置30min,6000r/min 离心15min 吸取上清液。
严格按照试剂盒说明书进行检测。
红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C 反应蛋白由山西医科大学第二医院检验科完成。
Th17、Treg 及部分细胞因子,由山西医科大学第二医院风湿免疫科实验室完成。
3.统计学方法：应用SPSS 25.0 统计学软件对数据进行统计分析。
符合正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示,不符合正态分布的计量资料以中位数(四分位数间距)[M(Q1,Q3)]表示。
组间比较采用Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis H检验。
变量间的相关性检验采用Spearman及多元线性回归分析,以P＜0.05 为差异有统计学意义。
1.TLR7 活性表达在RA 各组和健康对照组的比较：与健康对照组比较,RA 组外周血的TLR7 表达水平明显高于健康对照组(z=-2.53,P＜0.05);RA初发组明显高于健康对照组(P＜0.05),但与治疗组比较差异无统计学意义(P＞0.05),详见图1。
图1 TLR7 在RA 各组和健康对照组外周血活性表达
2.RA 组中TLR7 活性表达与病情活动度等指标相关性分析：Spearman相关分析显示RA 组TLR7 与CRP、受累关节数、DAS28 评分呈正相关(r=0.255,P＜0.05;r=0.247,P＜0.05;r=0.226,P＜0.05),而与病程、红细胞沉降率则无明显相关性 (r=0.007,P＞0.05;r=0.167,P＞0.05),详见表1。
表1 RA 组临床指标的统计学描述及TLR7 与其相关性分析
3.Pin1 活性在RA 各组和健康对照组外周血表达的比较：与健康对照组比较,RA 组外周血的Pin1 表达水平明显高于健康对照组,且差异有统计学意义(z=-6.26,P＜0.001); RA 初发组、RA 治疗组的Pin1 活性表达显著高于健康对照组(P均＜0.001),但RA 初发组与RA 治疗组间比较,差异无统计学意义(图2)。
图2 Pin1 在RA 各组和健康对照组外周血活性表达
4.RA 组外周血中TLR7 活性表达与Pin1 的相关性分析：将RA 组92 例患者测定的TLR7 与Pin1 活性表达量进行Spearman秩相关分析。
结果发现,TLR7 与Pin1 呈正相关,差异有统计学意义(r=0.206,P＜0.05)。
5.Th17 和Treg 绝对细胞计数在RA 组和健康对照组绝对计数比较：与健康对照组比较,RA 组外周血Th17 细胞计数明显增高(z=-3.53,P＜0.001),而Treg 细胞计数则显著降低(z=-4.06,P＜0.001)。
而RA 初发组和RA 用药组的Th17 细胞计数和Treg 细胞计数比较差异均无统计学意义(P均＞0.05),详见图3。
图3 RA 组和健康对照组Th17/Treg 比较
6.RA 组外周血中TLR7 活性表达与Th17 和Treg 的相关性分析：Spearman相关分析显示,RA 组TLR7 与Treg 呈负相关(r=-0.239,P＜0.05),而与Th17 虽有正相关趋势,但差异无统计学意义(r=0.031,P＞0.05),详见表2。
表2 RA 组TLR7 表达活性与Th17 和Treg 相关性分析
7.RA 组外周血中TLR7 活性表达与部分细胞因子的相关性分析：Spearman相关分析显示,RA 组TLR7 与IL-6 呈显著正相关(r=0.299,P＜0.01),而与IL-10、IL-17、TNF-α 无明显相关性(表3)。
表3 RA 组TLR7 活性表达与细胞因子相关性分析
8.RA 组TLR7 活性表达与Pin1、疾病活动度、Treg 及部分细胞因子多元线性回归分析：RA 组TLR7活性表达与Pin1、DAS28 呈显著正相关(BPin1=0.013,P= 0.028;BDAS28= 0.239,P= 0.035),而与Treg 呈明显负相关(BTreg=-0.020,P=0.002),详见表4。
表4 RA 组TLR7 活性表达与Pin1、疾病活动度、Treg 及部分细胞因子多元线性回归分析
RA 是一种常见的以慢性滑膜炎症为特征的自身免疫性疾病,发病机制复杂,其中,免疫细胞数量或功能紊乱参与该病的发生、发展,尤以CD4+T 淋巴细胞最为关键。
CD4+T 亚群种类多样,其中以Treg 细胞较为重要,主要因其可通过产生抗炎性细胞因子,从而具有免疫抑制、维持自身耐受和抑制自身免疫的作用。
Th17 细胞虽与Treg 细胞同源,但作用相反,主要发挥促炎作用。
此外,Th17 细胞和其他效应性T 细胞的活性也受到Treg 细胞的抑制[6,7]。
因此,维持Th17/Treg 细胞的平衡也是保持机体正常免疫的基础。
TLR7 激活可导致Treg 细胞的数量减少和功能抑制,而增强自身反应性Th17 应答。
TLR7 还可识别RA 患者血清和关节液中内源性的单链RNA,当其被激活后,通过髓样细胞分化因子88 经典途径,引起级联反应,产生TNF-α、IL-6、干扰素等促炎性细胞因子以及诱导树突状细胞和Th17 细胞的分化,从而导致骨破坏和炎性反应[8,9]。
还有研究发现,TLR7 在RA 滑膜组织中大量表达,活化的TLR7 可独立诱导STAT-3 信号通路活化核因子-κB 受体活化因子配体(nuclear factor-κB receptor activator ligand,RANKL) 表达, 进而刺激破骨细胞的生成与分化[10,11]。
本研究结果显示,TLR7 在RA 患者外周血过表达,且与CRP、受累关节数、DAS28 评分呈显著正相关。
多元线性回归分析也进一步证实,RA 患者TLR7 表达与DAS28 评分呈显著正相关。
Chamberlain 等[12]研究发现,TLR7 在RA 患者外周血中存在过表达的现象,且与DAS28 评分呈正相关。
这与本研究结果相符。
另外,还有报道,TLR7 在原发性干燥综合征(primary Sjögren syndrome, pSS)、系统性红斑狼疮等也过表达,且参与了疾病的发生、发展[13,14]。表明TLR7 过表达是RA 等自身免疫性疾病发病的关键因素之一。
TLR7 和Pin1 可以互相作用,一方面,TLR7 可以激活异构酶Pin1,从而启动下游级联反应,诱导干扰素的释放;另一方面,Pin1 又可上调TLR7 的活性,刺激破骨细胞的活化以及金属蛋白酶和促炎介质等的产生,从而导致骨破坏和炎性反应[15,16]。
本研究发现,在RA 患者外周血中,Pin1 活性显著高于健康对照组,与既往研究结果一致,且Spearman相关分析及多元线性回归分析均证实Pin1 活性和TLR7 表达呈明显正相关[4]。
表明Pin1-TLR7 途径激活可能是RA 发病的原因之一。
本研究发现,RA 患者Th17 细胞计数明显高于健康对照组,而Treg 细胞计数低于健康对照组,与既往研究结果一致,表明Th17 细胞计数增高和Treg 细胞计数减少参与了RA 的进展[1,3,17]。
本研究进一步分析发现,TLR7 与Treg 呈显著负相关,而与IL-6 呈显著正相关,与TNF-α 也有正相关迹象,但差异无统计学意义。
多元线性研究也发现,TLR7 与Treg 呈显著负相关,与IL-6 有正相关趋势,但差异无统计学意义,这可能受多种因素影响,后期可通过动物实验进一步探索。
虽然Th17 和Treg 功能相互抑制,但二者分化都需要T 淋巴细胞受体和TGF-β,且Th17细胞极化需要额外的IL-6 调节[11,18]。
Chamberlain等12]研究发现,TLR 与TNF-α 呈正相关,而且TLR7还可能是TNF-α 反应基因,参与了RA 发病的慢性病程。
Wang 等[19]还研究发现,pSS 外周血和唾液腺中TLR7 和炎症标志物显著高于健康人,这表明TLR7 信号在局部和全身性疾病中均发挥重要作用。因此,Pin1-TLR7 途径激活及Treg 降低致免疫耐受缺陷可能是RA 发病的主要原因之一。
本研究发现,RA 初发组和RA 用药组中TLR7、Pin1 活性均明显高于健康对照组,但在RA 初发组和RA 用药组中TLR7、Pin1 活性无明显差异,这可能与两组患者均处于疾病活动有关。
综上所述,RA 患者外周血TLR7 过表达,且与Pin1 过表达、Treg 降低及疾病活动度均相关。
因此,Pin1-TLR7 途径激活及Treg 降低致免疫耐受缺陷可能是RA 发病的主要原因之一。
抑制TLR7,或者抑制Pin1-TLR7 信号通路,可能是治疗RA 和其他自身免疫性疾病的一种有前途的治疗策略。
本研究尚存在一些不足之处。
如有相关文献报道TLR7 与TNF-α 呈正相关,但在本实验中虽有正相关趋势,但差异无统计学意义。
后期笔者将扩大样本量进一步探索二者的关系,并通过动物实验,深入研究RA的发病机制。
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