曾 蓉, 徐丽慧, 高士刚, 宋志伟, 高 萍, 戴富明
(上海市农业科学院生态环境保护研究所, 上海市设施园艺重点实验室, 上海 201403)
茼蒿Glebioniscoronaria,为菊科Asteraceae 茼蒿属Glebionis作物,1年或2年生草本,茎和叶可以同食,药蔬兼优,我国大部分地区都有种植。茼蒿属于小宗蔬菜作物,作为十字花科叶菜主要轮作作物和搭配作物在上海地区广泛种植。茼蒿常发生的病害有霜霉病、叶斑病等,这些叶部病害严重影响产量和品质。
2020年11月,本研究组在上海市奉贤区庄行综合试验站调查时,在茼蒿种植大棚中发现一种叶部病害,严重时整片叶子枯死,田间株发病率95%以上。为明确引起该病害的病原菌,本研究对田间采集的病害样品进行分离、纯化、培养,并采用形态和生物学特征、致病性、多基因核苷酸序列系统发育树分析等方法对分离物进行鉴定,明确引起茼蒿叶斑病的病原种类,且开展了药剂室内活性的测定,以期为该病害的防治提供参考。
1.1 材料
病样:采自上海市奉贤区庄行综合试验站种植的茼蒿。
琼脂、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、二甲基亚砜等生化试剂,中国医药集团有限公司;2×EasyTaqPCR SuperMix、2K plus DNA Marker等,北京全式金生物生物技术有限公司。
供试杀菌剂:95.4%己唑醇原药、95.2%苯醚甲环唑原药、97%戊唑醇原药、98%氟环唑原药、98%嘧菌酯原药、96.9%异菌脲原药、98%多菌灵原药、97%咪鲜胺原药由本研究室保存。
1.2 试验方法
1.2.1症状观察
2020年11月-12月,在上海市奉贤区庄行综合试验站基地观察茼蒿叶斑病危害症状及危害程度等。
1.2.2病原菌的分离与纯化
将有典型症状的发病初期叶片洗净,按组织分离法分离病原菌[1]。首先在病健交界处剪取直径6～8 mm的圆形叶片组织,用2%次氯酸钠消毒2 min,无菌水清洗3次,在无菌滤纸上晾干后置于含有50 μg/mL氯霉素和50 μg/mL链霉素的PDA培养基上,26℃黑暗培养,得到多个形态特征相同的分离物,挑取边缘菌丝进行分离物的纯化,挑选分离物TH11290202保存于实验室备用。
1.2.3分离物的形态学及生物学特性
参考徐丽慧等[2]的方法对分离物TH11290202进行形态学鉴定,在26℃黑暗培养,观察其在PDA、PSA培养基的培养特征。在显微镜下观察菌丝等形态特征如颜色、形状、质地等。
参考曾蓉等[3]的方法测试菌落生长适宜温度:用打孔器在活化的菌落边缘取直径6 mm的菌饼,接种在PDA培养基中央,设置18～36℃ 每2℃为1个间隔的10个梯度温度,黑暗培养7 d后,用十字交叉法测量菌落直径,同一批次测定分离物在不同温度下的生长速率,试验重复3次。
1.2.4致病性测定
采用菌丝悬浮液喷雾法进行接种,在室内培养茼蒿至5～8叶期,将分离物的PDA培养物用无菌水匀浆后进行叶面喷雾,每日观察植株的发病情况,接种7 d后从发病植株的叶片发病部位重新分离病原菌,进行柯赫氏法则验证。喷施等量无菌水为对照,每个处理3盆,每盆3～5株,3次重复,在26℃、相对湿度90%,12 h光/暗交替的条件下培养。
1.2.5病原菌多基因联合鉴定
将分离物TH11290202在PDA培养基上26℃培养3 d后,挑取少量菌丝,参考Harju等[4]的方法提取真菌基因组DNA。对分离物分别选择核糖体DNA转录间隔区 (internal transcribed spacers, ITS)引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[5]、真核生物翻译延伸因子1α(translation elongation factor, TEF)引物EF1-728F(5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′)/EF1-986R(5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′)[6]、钙调蛋白 (calmodulin, CAL) 基因引物CAL-F(5′-CTTCTGCATCATGAGCTGGAC-3′)/CAL-R(5′-GAATTCAAGGAGGCCTTCTC-3′)[7]、肌动蛋白 (actin, ACT) 基因引物ACT-512F(5′-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3′)/ACT-783R(5′-TACGA-GTCCTTCTGGCCCAT-3′)[8]进行核苷酸片段扩增和测序,引物合成和测序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。PCR扩增使用20 μL反应体系,包括: 2×EasyTaqPCR SuperMix(北京全式金生物生物技术有限公司)10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 8.0 μL。PCR反应程序参考各引物出处文献。
以Alternariaalternata为外群参考序列,将分离物的序列与已经发表的ITS、TEF、CAL、ACT等序列经Clustalx 1.83做完全比对,并手动截齐两端,相关序列信息见表1。使用Sequence Matrix 1.80 软件[9]按ITS-TEF-CAL-ACT顺序连接成多基因联合序列。基于邻接法(neighbor-joining,NJ),设置自展值(bootstraps)为1 000,用MEGA 7构建系统发育树[10]。
表1 本研究所用菌株及其序列信息
1.2.6室内药剂筛选
采用菌丝生长速率法测定供试杀菌剂对分离物的毒力,具体步骤参考刘欣等[11]的方法。己唑醇、苯醚甲环唑、戊唑醇等8种杀菌剂原药用二甲基亚砜(DMSO)溶解成所需浓度的母液,多菌灵原药用2 mol/L的盐酸溶解,取1 mL母液加入到99 mL的50℃左右的PDA培养基中,充分混匀后制成含药培养基平板(直径9 cm);以只添加DMSO或盐酸的PDA培养基为对照。用打孔器在活化的培养基边缘取直径6 mm的菌饼,接种在PDA含药培养基平板中央。每种杀菌剂设置5个浓度梯度,重复3次,26℃黑暗培养7 d后,用十字交叉法测量菌落直径,用如下公式计算菌丝生长抑制率。
菌丝生长抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-6)×100%。
试验数据使用Excel 2016进行处理,采用DPS 7.05进行分析[12],求出斜率、标准误、卡方值、自由度、有效中浓度(EC50)、95%置信限。
2.1 田间症状
在秋冬季节,病原物主要侵染茼蒿叶片,叶片出现 “蛙眼”状圆斑,外围灰褐色、中央灰白色,是典型的尾孢菌引起的症状;后期整叶变褐、变黑,严重时整株枯死,圆叶和尖叶型茼蒿品种均可被侵染(图1),株发病率高于95%。
图1 茼蒿叶斑病田间症状Fig.1 Symptoms of leaf spot on Glebionis coronaria plants in field
2.2 病原菌形态及生物学特性
组织分离后2 d组织块周围长出白色菌丝,经菌落边缘纯化后获得15个分离物,命名为TH11290201-TH11290215,这些分离物的菌落生长速度、颜色特征一致,本研究选取了分离物TH11290202为代表。
分离物TH11290202在PDA、PSA培养,菌丝生长较慢,紧贴培养基生长,在PDA和PSA培养基上形态较一致,正面白色或灰色,背面呈深灰色(图2),茼蒿叶斑病菌丝生长最适宜温度是 26℃ (图 3)。
图3 TH11290202菌株在不同温度下的菌丝生长速率Fig.3 Mycelial growth rate of strain TH11290202 under different temperature
2.3 分离菌株对茼蒿的致病性
茼蒿苗期接种TH11290202后7 d,植株叶片出现灰褐色斑点,后期变大、整叶枯萎,与田间症状相似,而对照无症状(图4),从接种叶的发病部位重新分离获得的分离物与TH11290202形态特征一致,进一步说明了TH11290202是引起茼蒿叶斑病的病原菌。
图4 茼蒿叶斑病病原菌致病性试验Fig.4 Pathogenicity test of leaf spot strain TH11290202
2.4 分子生物学鉴定
利用ITS、TEF、CAL和ACT4个基因序列引物对分离物TH11290202进行PCR扩增,分别获得长度为537、306、595、227 bp的片段,序列的GenBank登录号分别为:MW819910、MW981277、MW981278、MW981279。测序结果经BLASTn显示,菌株TH11290202的ITS序列与芹菜尾孢Cercosporaapii、辣椒尾孢C.capsici、大豆尾孢C.sojina等多种尾孢菌ITS序列相似性高达99.26%～99.81%;TEF序列与芹菜尾孢、甜菜尾孢C.beticola、芦笋尾孢C.asparagi等多种尾孢菌TEF序列的相似性高达98.37～100%;CAL序列与辣椒尾孢、甜菜尾孢、芦笋尾孢、芹菜尾孢等多种尾孢菌CAL序列的相似性为93.25%～99.76%;ACT序列与甜菜尾孢、芹菜尾孢的ACT序列的相似性为99.55%～100%。结果表明:分离物TH11290202的ITS、TEF、CAL和ACT4个基因序列均与尾孢菌属相似性最高,但尾孢属的近缘种较多、序列相似性高,仅凭单个基因序列BLASTn方法难以准确鉴定到种。
基于ITS、TEF、CAL和ACT等4个基因联合序列,经NJ法构建了分离物TH11290202的多基因系统进化树(图5)。在该进化树中,分离物TH11290202与芹菜尾孢聚集在一个分支,自展值为97。
图5 基于ITS, TEF, CAL和ACT多基因序列联合构建的NJ系统发育树Fig.5 NJ phylogenetic tree based on ITS, TEF, CAL and ACT sequences
2.5 室内药剂筛选
己唑醇、苯醚甲环唑、戊唑醇、氟环唑、嘧菌酯等5种药剂对分离物TH11290202的菌丝生长抑制的EC50值分别为0.042 3、0.060 4、0.317 4、 0.452 4、0.863 3 μg/mL,异菌脲、多菌灵和咪鲜胺的EC50分别为4.732 0、14.750 3 μg/mL和29.548 7 μg/mL(表2);己唑醇、苯醚甲环唑、戊唑醇、氟环唑、嘧菌酯等药剂对分离物TH11290202具有良好的抑制作用。
表2 8种杀菌剂对茼蒿叶斑病病原菌菌丝生长的毒力
本研究对采自上海市奉贤区的茼蒿叶部病害进行了分离纯化、形态和生物学鉴定、致病性测定和柯赫氏法则验证,并对分离物的ITS、TEF、CAL和ACT的多基因序列联合的NJ系统发育树分析,结果显示病原菌分离物TH11290202与芹菜尾孢标准菌株 CBS 116455聚在同一分支,自展值为97,表明引起上海市奉贤区茼蒿叶斑病的病原为芹菜尾孢Cercosporaapii。
本文中茼蒿叶斑病菌的生长最适温度为26℃,与叶斑病发病时期(11月-12月)大棚内的温度基本吻合。在我国报道引起茼蒿叶斑病的病原菌有茼蒿尾孢C.artemisiae[13-14]、链格孢Alternariasp.[15]、木茼蒿链格孢A.argyranthemi[16]等。茼蒿尾孢在PDA培养基上菌落黄褐色, 上有白色菌丝, 边缘不整齐, 背面颜色较深, 常开裂[14];而本研究中的分离物在PDA上正面菌丝纯白色,边缘整齐,培养至20 d培养基不开裂。郭英兰等认为尾孢类真菌的分类依据主要是产孢孔和孢脐的结构,色泽和孢痕疤的厚度,分生孢子梗和分生孢子色泽[17-18]。本研究探索了该分离物的产孢方法,在PDA、PSA、查氏培养基、辣椒叶、玉米叶、茼蒿叶等培养基上均很难产孢,参考赵立萍[19]、赵正龙等[20]的方法应用V8汁培养基、玉米叶粉碳酸钙琼脂培养基 (maize leaf carbonate agar, MLPCA)、辣椒叶粉碳酸钙琼脂培养基(pepper leaf carbonate agar, PLPCA)等诱导孢子都未成功(结果未列出),给该分离物的鉴定带来一定困难。
Inglis等、Conway、Montenegro-Calderón等[21-23]的研究证实,ITS区对大多数尾孢缺乏种间的区分能力。通过 ITS、TEF、CAL和ACT4个基因核苷酸序列的分析,分离物TH11290202的ITS序列与芹菜尾孢、辣椒尾孢、大豆尾孢等多种尾孢属ITS序列相似性都超过了99%;芹菜尾孢与甜菜尾孢两个种的TEF、ACT序列相似性都高于99%,TEF和ACT序列亦难以区分这两个种;芹菜尾孢与甜菜尾孢相似性在97%左右,与C.asparagi则相似性高于99%。芹菜尾孢能侵染芹菜,Groenewald 等通过ITS,TEF,ACT和CAL联合建树的方法将67株尾孢分离物分为芹菜尾孢、C.apiicola与甜菜尾孢3组[24]。DNA序列信息结合菌落形态特征给尾孢菌的分类提供了重要的帮助,多基因序列联合建树鉴定病原菌的方法已经广泛应用于植物病害的研究[25-28]。
本研究对分离物TH11290202的室内药剂筛选试验结果显示,8种杀菌剂原药对菌丝生长的抑制作用大小为:三唑类(己唑醇、苯醚甲环唑、戊唑醇、氟环唑)>甲氧基丙烯酸类(嘧菌酯)>二甲酰亚胺类(异菌脲)>咪唑类(多菌灵、咪鲜胺);另外,酰胺类杀菌剂EC50均超过100 μg/mL(结果未显示)。三唑类杀菌剂对分离物的抑制活性较强,EC50在0.04～0.32 μg/mL之间,若结合使用技术和田间药效登记试验,有望应用于田间病害的防控。酰胺类杀菌剂抑制活性较弱,是否与抗性风险相关需进一步的研究验证。这些结果为小宗作物的杀菌剂药剂登记提供重要的参考,为茼蒿叶斑病的防控提供重要依据。
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