孔卫青, 凌 君, 杨金宏
(安康学院, 陕西省蚕桑重点实验室, 安康 725000)
蚕桑产业是我国传统优势产业,近年随着生物技术的发展,蚕桑产业在食用、饲用、医药、化工等多个领域的应用得到不断拓展。桑叶是家蚕的唯一食物来源,桑叶的产量和质量对蚕桑产业的发展具有重要影响。植物病毒病可导致宿主品质降低、产量下降、甚至绝收,危害严重。近年常见桑叶病毒病的相关报道,病害导致桑叶卷曲、畸形、发黄、萎缩等,影响桑叶的产量和品质。迄今为止已报道的感染桑树病毒有桑花叶型萎缩病相关病毒(mulberry mosaic dwarf associated virus， MMDaV)[1]、桑花叶卷叶病相关病毒(mulberry mosaic leaf roll associated virus, MMLRaV)[2]、桑杆状DNA病毒1(mulberry badnavirus-1, MBV-1)[3]、桑脉带相关病毒(mulberry vein banding associated virus, MVBaV)[4]、桑花叶萎缩类病毒(mulberry mosaic dwarf viroid, MMDVd)[5]、柑橘叶斑病毒(citrus leaf blotch virus, CLBV)[6]、李坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus, PNRSV)、桑潜隐病毒(mulberry cryptic virus, MuCV)[7]、烟草线条病毒(tobacco streak virus, TSV)[8]等,分属于8个科。
陕西安康地区是我国优质茧丝生产基地,近年来调查发现桑园病毒病害日趋严重。小RNA(small RNA, sRNA)深度测序技术直接以宿主中sRNA为研究对象,是一种发现新病毒、监控病毒变异的有效方法,在植物、无脊椎动物和人体细胞病毒的鉴定和分类等方面有较多的应用[9]。本研究对安康主要桑树种植区进行采样调查,利用RT-PCR对9种病毒在样品中的存在情况进行鉴定,对MMLRaV、MMDaV、MMDVd和MuCV复合侵染的桑树叶片小RNA(small RNA,sRNA)进行深度测序和分析,为桑树病毒病的防控和抗病育种提供依据。
1.1 材料
2020年春在安康市汉滨区五里镇、大同镇、恒口镇等地调查桑病毒病发生情况,采集表现为畸形的桑树病毒病症状的叶片68份,-80℃冰箱保存备用。
1.2 RNA提取与RT-PCR扩增验证
利用EastepTMSuper 总RNA提取试剂盒(LS1040)提取桑树叶片的总RNA,反转录试剂盒(A5001)和2×PCR反应混合液(M7122)进行总RNA的反转录和PCR扩增,以桑树actin基因为内参对照,检测畸形桑树叶片中的病毒。扩增程序为:94℃ 5 min预变性;94℃ 30 s,52℃ 45 s,72℃ 1 min,30个循环;72℃延伸10 min。检测引物来自文献或利用Primer Premier 5.0设计(表1),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1 病毒检测引物1)
续表1 Table 1(Continued)
1.3 sRNA文库构建与测序
为进一步鉴定桑树中的病毒,对经RT-PCR检测复合感染了MMDaV、MMLRaV、MMDVd和MuCV的‘淮阴4号’桑树进行小RNA测序。取单株5个枝条,混合单枝条的3片桑叶为一个样本,共5个重复样本。以无病毒侵染的健康‘淮阴4号’桑树叶片为对照,3个重复。提取各样本总RNA,利用Qubit RNA检测试剂盒(Q32855,Life)进行定量,检测合格后送生工生物工程(上海)股份有限公司构建sRNA文库,Qubit DNA检测试剂盒检测合格的sRNA文库进行Hiseq 2500平台高通量测序。
1.4 候选病毒sRNA序列分析
对测序所得数据进行处理,去除接头和低质量数据,筛选长度为18～28 nt的sRNA,使用Bowtie 1.0软件和无参考基因组分析候选寄主病毒sRNA,统计sRNA数量、长度、5′-末端核苷酸组成。对基因组环状病毒,通过在完整基因组序列后面手动加入其自身的第1～27 nt序列作参考基因组进行分析。
2.1 侵染桑树的主要病毒种类检测
RT-PCR对68份畸形桑树叶片进行检测,结果共检测到MMDaV、MMLRaV、MMDVd、MuCV 4种病毒,其中MuCV只在1份样品中被检出,该样品同时检出了MMDaV、MMLRaV、MMDVd(图1b),为4种病毒的复合侵染(图1a)。MMDVd的检出率为47.06%,且所有检出MMDVd的样本均同时检测到MMDaV和MMLRaV(图1c)。MMLRaV的检出率为83.82%(图1d),MMDaV在68份样品均检测(图1e)。MBV-1、MVBaV、CLBV、PNRSV和TSV等5种病毒在本次采集样本中没有检测到。
图1 4种病毒复合侵染桑树的症状及病毒侵染样本的检测Fig.1 Symptom of mulberry infected by four viruses and the detection of samples infected by viruses
2.2 sRNA及其特征分析
去除低质量和长度小于18 nt大于28 nt的测序数据,复合侵染桑树样本和对照样本分别得到sRNA序列58 920 928条和32 715 082条,数据过滤后复合侵染桑树样本获得病毒sRNA序列6 470 767条,对照样本仅获得74条,几乎没有病毒来源序列(表2)。与GenBank病毒数据库和桑树病毒序列进行比对,所得sRNA可以比对到MMDaV、MMLRaV、MMDVd、MuCV 4种病毒的核酸序列,与前述RT-PCR鉴定结果一致。
表2 复合侵染和对照桑树样本的sRNA数
统计sRNA的长度,MMLRaV、MMDVd、MuCV的sRNA长度以21 nt最多,而MMDaV的sRNA长度以24 nt最多(图2)。分别统计来自本研究4种病毒基因组链和互补链的sRNA的末端序列(图3),结果显示MMDaV基因组链sRNA的5′-末端以A和T为主,分别占总数的37.10%和32.39%,互补链以A为主,占总数的44.57%。MMLRaV和MMDVd基因组链sRNA的5′-末端以T最多,均占总数的50%以上,而其互补链刚好相反,以A和G居多。MuCV基因组链sRNA的5′-末端以C最多,占总量的54.15%,互补链主要为A,占其总量的70.66%。
图2 4种病毒sRNA长度分布Fig.2 Length distribution of sRNA from four viruses
图3 4种病毒基因组链和互补链sRNA 5′-末端碱基Fig.3 The 5′-terminal nucleotide bias of sRNA from genomic and negative strands of four viruses
随着检测技术的发展,近年来报道的病毒种类不断增多,同时,由于媒介昆虫能传播多种病毒,植物病毒的复合侵染现象时常发生。桑树病毒病在我国江苏、广东、广西、陕西等地均有发生,且复合侵染现象严重,发生症状多为卷叶、花叶、皱缩等,难以区分,如孙勋勋等[10]从皱缩状和花叶状桑叶样品中同时检测到MMDaV和MVBaV,Ma等[1]从畸形的桑树叶片中同时检测到3种病毒MMDaV、MMLRaV和MMDVd。本文利用RT-PCR对安康地区3个蚕桑重点镇桑园的68份桑叶样本的感染情况进行了检测,发现了最多4种病毒的复合侵染。
MMDaV为双生病毒科Geminiviridae成员,又被称为桑树皱叶病毒(mulberry crinkle leaf virus, MCLV),目前的研究主要集中在病毒的检测,先后建立了酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、核酸斑点杂交(nucleic acid spot hybridization,NASH)、基于SYBR GreenⅠ的qPCR检测等方法[12-14]。柴建萍等对发病桑园中半翅目Hemiptera粉虱科Aleyrodidae桑粉虱Pealiusmori的研究显示,其可通过取食获毒,是该病毒的携带者和传播媒介[15]。但关于MMDaV的侵染性、宿主范围及其损害评估等缺乏相关研究。MMLRaV为豇豆花叶病毒科Comoviridae成员,2014年卢全有在花叶卷叶症状桑叶中发现[2]。MMDVd为植物亚病毒感染因子,又称为小分子环状RNA(mulberry small circular RNA,mscRNA),最新研究显示其为MMLRaV的卫星RNA。MuCV为双分病毒科Partitiviridae成员[7],2020年在陕西安康地区发现,MuCV的感染是首次在我国发现,该病毒引起症状不显著,同时存在于无症状桑叶中,给桑树病毒病的预防和防治提供了参考。
植物在对抗病毒侵染的过程中,通过RNA沉默机制靶向病毒基因组可产生病毒小RNA[16],近年来,利用小RNA深度测序发现和检测植物病原应用广泛。本文对复合病毒感染的畸形桑叶进行了小RNA深度测序,分析叶片感染的病毒,所得结果与RT-PCR鉴定一致,未发现其他新病毒。病毒sRNA的产生和其在寄主体内的复制机制有关,本文进一步分析4种病毒sRNA的长度和5′-末端组成。从长度组成,3种RNA病毒MMLRaV、MMDVd和MuCV的sRNA长度主要为21 nt,DNA病毒MMDaV以24 nt最多,与非洲木薯花叶病毒(African cassava mosaic virus, ACMV)中的研究一致[17],说明3种RNA病毒和DNA病毒由不同Dicer-like(DCL)蛋白加工生成[18]。不同sRNA的5′-末端组成决定了其结合的宿主蛋白[19-20],5′-末端序列组成方面,MMLRaV和MMDVd比较一致,与MuCV和MMDaV均不相同,说明本研究复合病毒侵染桑树中存在多个sRNA识别装载机制,为桑树病毒的复制侵染机制研究奠定了基础。
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