杨开智 梁 丹 黄生林
（常德市畜牧水产事务中心，湖南 常德 415000）
磺胺类（Sulfonamides,SAs）药物为常见的合成抗菌剂，主要用于预防和治疗细菌性感染疾病，具有抗菌谱广、低毒高效、组织穿透力强，并且价格低廉等特点，在水产养殖中得到普遍的使用。但这类药物的大量使用会导致在水产品中的残留，进而通过食物链危害人类的健康。SAs药物对人体肾脏和肝脏有损害的毒副作用，破坏人的造血系统，引起溶血性贫血症，而磺胺二甲基嘧啶甚至有潜在的致癌可能。同时这两类药物在养殖中大量的使用，均容易使病原体产生耐药性[1]。
目前测定动物源性食品中磺胺类药物残留的方法主要有高效液相色谱法（HPLC）[2-3]和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[4-5]。液相色谱法一般使用紫外和荧光检测器，由于动物源性食品中蛋白质和脂肪含量较高、基质复杂等原因，采用该方法容易受杂质影响，并且分析时间较长，较费时费力。近年来，对这两类药物残留同时检测的报道也越来越多，但是大部分集中在畜禽组织和牛奶中。
本文针对农业部水产品检测中心在水产品例行监测中经常检测的8 种磺胺类药物建立了同时测定的液相色谱-串联质谱法，该方法提高了色谱分析的功效，简单快速，灵敏度高，而且节约成本，能实现药物残留的快速检测，适合水产品当中磺胺类药物的残留检测。
1.1 仪器与试剂
Thermo TSQ Quantum 液相色谱- 高分辨串联四级杆质谱联用仪，配用电喷雾离子（ESI）源（Thermo 公司）。超声波清洗器（昆山超声波仪器厂），平行旋转蒸发仪（瑞士Buchi(布奇)公司），高速冷冻离心机（日本日立公司），微型漩涡混合仪（上海沪西分析仪器厂），精密电子天平（梅特勒—托利多称重设备系统有限公司）。
磺胺类药物标准品（磺胺噻唑、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺多辛、磺胺嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺喹恶啉）以及内标物（氘代磺胺间二甲氧嘧啶、氘代磺胺邻二甲氧嘧啶） 的纯度不低于99.8%；
甲醇、甲酸、醋酸铵均为色谱纯（美国Tedia 公司）；
无水硫酸钠：分析纯，于650 ℃下灼烧4 h 后储存于干燥器中备用。
标准储备液的配置：分别称取磺胺类药物标准品各10.0 mg，用甲醇溶解后转移至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容配置成100 mg/L 的标准储备液，在-18 ℃下避光保存。使用时将上述标准储备液混合，用甲醇稀释成不同浓度的标准工作液。
内标储备液及使用液的配置：分别称取10.0 mg 各内标标准品，用甲醇溶解并定容，配成100 mg/L 的标准储备液，在-18 ℃下避光保存。准确吸取各内标储备液，用甲醇逐级稀释配成1.0mg/L 的混合内标使用液，在-18 ℃下避光保存。
1.2 仪器分析
1.2.1 色谱条件
色谱柱为Capcell Pak C18(MGⅡ，150 mm×2.1 mm，5 μm)；
柱温为30 ℃，进样量为10μL，流动相A 为甲醇；
B 为2 mmoL/L 的乙酸铵溶液（含0.1%的甲酸）；
梯度洗脱程序为：0-6 min，10%A-60%A；
6-8 min，60%A-80%A；
8-13 min，80%A-90%A；
13-14 min，90%A-10%A，并保持2 min；
流速为250 μL/min。
1.2.2 质谱条件
采用大气压电喷雾离子源（ESI），正离子模式；
喷雾电压为4 000 V；
离子传输毛细管温度为350 ℃，Q1 半峰宽为0.7Da；
Q3 半峰宽为0.7Da；
碰撞气氩气压力为1.5 mTorr；
鞘气流量为10 L/min；
辅助气流量为2 L/min；
采用选择反应监测模式（SRM），各种磺胺类药物的母离子、子离子和碰撞能量见表1。
表1 10 种药物的SRM 采集参数和标准曲线
1.3 样品前处理
称取5 g 样品（精确至0.01 g）至于离心管中，加入10 g 烘干备用的无水硫酸钠后，立刻用玻璃棒搅匀，然后加入20 mL 乙腈提取液，在漩涡混合仪上充分混合1 min，然后再超声振荡20 min，平衡后放入离心机5 000 r/min 离心10 min 待分层，吸取上层清液至100 mL 鸡心瓶中，重复加20 mL 乙腈提取液提取一次，合并乙腈提取液，于40 ℃水浴中旋转蒸发至干。准确加入1.0 mL 甲醇-2 mmol/L 乙酸铵溶液（2∶8，V：V，含0.1%甲酸）溶解残渣，为了防止脂肪和杂质的影响，加入2.0 mL 正己烷去脂，漩涡混匀1 min，取下层液体过0.22 μm 滤膜，供液质联用仪分析。
2.1 前处理条件的选择及优化
由于水产品成分比较复杂，基质中含有大量的脂肪、蛋白质、碳水化合物以及色素等杂质。本文比较了乙腈和正己烷两种提取液，两种提取液回收率均满足要求，但是由于正己烷对脂肪溶解度大，容易造成对质谱的污染。而乙腈能提取大多数目标物，并且提取效果好，乙腈使蛋白质变性凝结沉淀下来后通过离心除去；
前处理中加入无水硫酸钠是为了有效除去水产品基质当中含有的水分，同时无水硫酸钠还可以促使使蛋白质变性分散，防止样品结成块状影响提取效果；
最后加入正己烷可溶解一些脂肪、蛋白质和色素，经离心后除去，过0.22 μm 滤膜后溶液清亮，回收率实验满足要求。
本文对定容溶液进行了选择，有研究采用甲醇-水（2∶8，V：V）进行定容[6]，本实验发现当使用甲醇- 水（2∶8，V：V） 定容时，溶液浑浊，但进样后峰形不尖锐，有加合峰，分叉峰出现，信号灵敏度下降，保留时间不稳定；
经多次试验，发现采用甲醇-2 mmol/L 乙酸铵溶液（2∶8，V：V，含0.1%甲酸）定容，溶液澄清，进样后色谱峰峰形尖锐，对称性好，保留时间稳定，回收率也满足分析要求。因此本文采用甲醇-2 mmol/L 乙酸铵溶液（2∶8，V：V，含0.1%甲酸）作为定容溶液。
2.2 色谱条件的选择及优化
流动相的PH 值会影响磺胺类药物在色谱柱中的分离。本实验比对了甲醇-水，甲醇-甲酸水溶液（0.1%），甲醇-乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）三种不同的流动相。当采用甲醇-水为流动相时，各种磺胺类药物几乎在同一时间被洗脱，而且出峰时间极短，大概在1min 之内出峰，这可能是由于磺胺类药物在中性流动相中具有相同的保留因子，而出峰时间太快对质谱会造成污染；
当采用甲醇-甲酸水溶液（0.1%）作为流动相时，各种目标物峰形得到了较大的改善，保留时间也较稳定，但SAs 中几种目标物出现拖尾现象，峰形不够尖锐；
本实验考虑采用挥发性电解质乙酸铵来做为流动相，同时加入0.1%甲酸控制流动相PH 值，采用合适的梯度洗脱程序，不但很好的实现了各种目标物的分离，并且得到了比较理想的色谱峰，峰形尖锐且对称性好，增大了分子离子峰的峰强度。见下图1。
图1 空白基质中10.0μg/kg 磺胺类药物加标样品离子色谱图
2.3 质谱条件的选择及优化
根据目标物的结构特征，选择ESI 正离子电离模式对1.0 mg/L 的8 种磺胺类混合标液进行一级质谱全扫描分析，m/z 扫描范围为200-400 之间，得到每种药物的分子离子，然后以该分子离子为母离子，进行子离子扫描，选取丰度最强的碎片离子为定量离子，丰度次强的碎片离子为定性离子。在此基础上对锥孔电压和碰撞能量进行优化，使选定的母离子和子离子组成的特征离子的丰度和比例达到最佳。得到1.2.2 中最佳质谱条件。
2.4 线性范围和灵敏度
磺胺二甲异恶唑、磺胺喹恶啉以氘代磺胺间二甲氧嘧啶为内标；
磺胺噻唑、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺多辛、磺胺嘧啶以氘代磺胺邻二甲氧嘧啶为内标。配置10.0-500.0 μg/L 的混合标准溶液，以标准品与内标物峰面积比值Y 为纵坐标，工作溶液的质量浓度X(μg/L)为横坐标制作标准曲线，结果表明，各种SAs 的线性关系良好，相关系数符合要求，见表1。
在空白样品基质中添加8 种磺胺类药物的混合标准溶液，以每种目标峰高的信噪比（S/N）大于5 确定为方法的检出限，信噪比（S/N） 大于10 确定为方法的定量限，9 种SAs 的检出限(LOD) 为1.0 μg/kg，定量限(LOQ)为2.0 μg/kg，表明该方法满足国家对水产品检测的要求。
2.5 回收率与精密度
在空白样品中添加5、10、50μg/kg 三个水平的添加实验，每个添加水平进行3 次实验，每次平行测定6 次，按1.2 节所述条件进行加标回收率实验，所得回收率结果为69.5%-121.9%，相对标准偏差为3.5%-14.6%，符合国内外有关标准和法规的要求[7]，结果见表2。
表2 8 种药物在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差（RSDs，n=6）
2.6 实际样品测定
运用本文建立的方法对市场中的20 个水产品样品进行了分析检测。结果表明：该方法简单、快速，具有很好的适用性和可操作性，谱图无干扰，样品中未检出9 种SAs 药物。
本方法适用于各种不同基质的水产品及其制品中磺胺类药物的测定，前处理方法步骤简单、试剂用量少、回收率稳定、精密度好，方法的定量限为2.0μg/kg，满足我国以及欧盟等国家的限量要求，可以作为水产品及制品中磺胺类药物的检测方法，并可为该类药物在水产品中的消除规律及毒理评价提供灵敏、准确的分析手段，为水产品的安全工作提供了有力的保障。
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