郭晓霞 孙俊毅 刘晓斌**
(1.陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712000；
2.西安交通大学口腔医院，陕西 西安 710004)
根管冲洗是根管治疗的主要步骤之一，能有效冲洗掉根管内感染细菌、残留牙髓和根管预备切削的牙本质碎屑，维持根管的清洁[1]。良好的冲洗液[2]还应具有广泛的抗菌谱和高效抗菌性、溶解牙髓和坏死组织、表面张力低到达根管预备器械无法到达的区域如牙本质小管、残留冲洗液也能提供长期抗菌效果、无毒无致癌等副作用[3]。我科采用冰硼冲洗液根管冲洗取得较好效果，现通过体外实验研究,对比临床中常用的疗效确切的1%NaClO液，探讨其对根管内粪肠球菌感染的疗效。
1.1仪器 YQX-Ⅱ厌氧培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司);DG3022全自动酶联免疫测定仪(华东电子管厂，德国);GU-P204便携式电动牙钻机(上海硅莱医疗器械有限公司)。
1.2试药 2.5%NaClO 溶液(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)；
17% EDTA 溶液(江西凯隆化工有限公司);PBS(福州迈新生物技术开发有限公司)。复方冰硼冲洗液：由冰片、硼砂、玄明粉、石膏、徐长卿5味中药配制而成(由陕西中医药大学第二附属医院中药房提供并配制)。每250 mL复方冰硼冲洗液含冰片2 g、硼砂5 g、玄明粉5 g、石膏15 g、徐长卿15 g，制备方法：石膏水煎30 min后加入徐长卿再煎30 min，取上清液250 mL加入冰片、硼砂、玄明粉，冰箱4℃保存，使用前取出溶液摇匀即可。
1.3实验菌株E.faecalis国际标准株(ATCC33186，美国菌种保藏中心);脑心浸液粉(Brain Heart Infusion，BHI)(法国生物梅里埃公司)；
琼脂粉(杭州微生物试剂有限公司)。
2.1离体牙收集与处理
2.1.1离体牙收集 收集因正畸原因被拔除、未接受过牙体牙髓治疗的离体、单根、直牙35颗，要求牙体保持完整、未行牙髓治疗、根管圆形。去除根尖周软组织，清洁牙面保存在生理盐水中备用。
2.1.2离体牙处理 在流动水冷却下，距离根管孔13 mm处用金刚砂片高速截去牙冠，保留牙根，用拔髓针去除牙髓组织，K型锉预备至20#疏通根管、建立通畅通道，应用1% NaClO和17%EDTA交替冲洗。水冷却下用砂片在距离离体牙根尖孔5 mm处垂直于牙体长轴磨出环形凹槽，但不穿透根管壁。用流动树脂将根尖孔和牙根外侧封闭。所有离体牙均独立置于含5 mLBHI培养液中密封，高温高压消毒灭菌(121℃，15 MPa，20 min)。所有样本置于37℃厌氧培养(80%N2、10%CO2、10%H2)24 h，培养液保持透明，表明灭菌效果可靠。
2.2建立粪肠球菌感染离体牙根管模型 参照前期制备粪肠球菌感染根管模型的方法[4]，取粪肠球菌标准株(ATCC33186)常规复苏，划线接种于BHI琼脂培养基上，37℃厌氧(80%N2、10%CO2、10%H2)培养24 h，根据革兰染色镜检和生化鉴定，证实无其它细菌污染，挑选单个菌落接种在BHI液体培养基中培养8 h，并调节菌悬液浓度为 D(A630)1.0。
根管内注入菌悬液(菌悬液以平齐根管口为准)，试管内加入10 mL无菌BHI 培养液，每48 h更换新鲜无菌BHI培养液，共孵育4 w。随机选取5颗逐步稀释培养在BHI琼脂培养基，确认培养过程无污染。培养结束后，余30颗离体牙无菌条件下取出，生理盐水冲洗根管，气枪干燥10 s，将无菌干燥纸尖分别置入根管中达工作长度，停留1 min，取样。
2.3分组处理 空白组：生理盐水+超声荡洗1 min，10颗离体牙；
阳性对照组：1%NaClO+超声荡洗1 min，10颗离体牙；
治疗组：冰硼溶液+超声荡洗1 min，10颗离体牙。
为了保持样本统一性，要求所有离体牙根管预备后形态一致。首先采用标准法预备至40#达工作长度，0.06锥度K3镍钛器械采用冠向下法预备至30#，此时预备至11 mm，达到所有离体牙根管长度、锥度、形态一致。预备过程中每更换器械使用各组冲洗液冲洗，最后一次冲洗完用生理盐水冲洗根管，气枪干燥10 s，取样。
2.4细菌计数 根管内细菌计数：各组取样放入装有1 mL生理盐水的Eppendorf管中，摇匀振荡1 min，10倍系列稀释后接种于BHI琼脂培养基上，培养24 h后计算菌落数(CFU·mL-1)。
根尖4 mm不同牙本质深度内细菌计数：所有离体牙从凹槽处截断，保留距根尖5 mm牙根，生理盐水冲洗干净，除去残留碎屑，依次使用60#、80#、100#不锈钢K锉在根管内旋转各8圈，总计达到牙本质深度4 mm，提取牙本质小管深度0～100 μm、100～200 μm、200～300 μm内残留存活的粪肠球菌，用1 mL生理盐水将提取的管壁和K锉的粉末冲洗至无菌Eppendorf管中，摇匀振荡1 min，10倍系列稀释后接种于BHI琼脂培养基上，培养24h后计算菌落形成单位(CFU·mL-1)。
3.1根管预备冲洗前后根管内细菌计数结果比较 根管预备冲洗前，空白组、阳性对照组、治疗组根管内细菌数量差异不大(P>0.05)；
根管预备冲洗后，三组根管内细菌数量均不同程度降低，组间比较，阳性对照组和治疗组之间无显著差异(P>0.05)，但两组细菌计数结果均明显低于空白组，存在显著差异(P<0.05)，见表1。
表1 根管预备冲洗前后三组根管内细菌计数结果比较
3.2根管预备冲洗后对根尖4 mm不同牙本质深度内细菌计数结果比较 三组随着牙本质深度增加，均呈现出抗菌效果逐渐降低的现象，空白组降低最明显，阳性对照组和治疗组降低相对较少，虽然在不同牙本质深度阳性对照组和治疗组抗菌效果无显著差异，但是牙本质0～100 μm、100～200 μm区域细菌计数阳性对照组<治疗组，而牙本质200～300 μm区域细菌计数治疗组<阳性对照组，说明随着牙本质深度增加，治疗组抗菌效果降低幅度最小。
表2 根尖4 mm不同牙本质深度内细菌计数结果比较
本研究建立感染根管模型选择的细菌是粪肠球菌[5]，这是因为粪肠球菌是根管内最难清除干净的细菌[6]，在根管治疗失败、难治性根尖周炎病例中检出率高[7]，一方面粪肠球菌在营养物质缺乏、恶劣环境中生存能力很强，其黏附于牙本质小管内或管间牙本质，以生物膜状态生存[8-9]；
另一方面，研究发现，粪肠球菌对常用的根管治疗药物如：NaClO、氢氧化钙存在耐药性[10]。最后，课题组前期已经成功制备了粪肠球菌感染模型，技术成熟。
本研究选择1%NaClO作为阳性对照，NaClO溶液是目前临床上最为推荐使用的根管冲洗液[11]，大量实验证明NaClO溶液对粪肠球菌具有良好的抗菌能力[12]。其通过氯化作用和强氧化作用获得良好的抗菌作用，溶于水后产生的NaOH、HOCl使其获得良好的组织溶解能力[13]。NaClO溶液也存在很多不足之处[14]，比如：临床常选用的NaClO溶液浓度为1%～5.25%，浓度增加会提高抗菌能力，但同时会增加对组织的刺激损伤、降低牙本质抗弯强度和弹性模量[15]，故学者们在不断寻找新的根管冲洗液。
冰硼冲洗液[16]含有冰片、硼砂、玄明粉，其中冰片味辛苦微寒，能清热止痛、泻火解毒。硼砂具有清热解毒，消肿防腐的作用。玄明粉咸寒软坚，清热、导热下行；
为提高抗菌和清洁效果[17]，本研究在遵循中医组方原则基础上，又加入具有石膏和徐长卿两味中药，石膏辛甘性寒，善清泻邪热[18]；
徐长卿具有解毒镇痛的作用[19]。诸药合用，在清热泻火，解毒镇痛等方面具有显著疗效。
本研究结果提示：1%NaClO溶液冲洗根管，配合使用超声冲洗设备，对根管壁定植的粪肠球菌有极高的抑菌效果，与以往学者研究报道一致[20]。使用冰硼液联合超声冲洗根管，与1%NaClO联合超声冲洗组，对根管壁粪肠球菌的抗菌效果没有显著差异，说明冰硼液抗菌效果明显。
综上所述，冰硼液可以有效清除感染根管表面和根尖4 mm不同牙本质深度的粪肠球菌。但仍存在许多不足：由于本研究在体外牙模型上进行，与患者根管内细菌感染状态尚有差异；
现有组方剂量的冰硼液是否为最佳抗菌浓度尚不清楚，有待于进一步研究。