赵重博 王晶 祁春艳 武旭 张丽娟
(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；
2.潼关县人民医院，陕西 渭南 714300)
南星为天南星科植物天南星Arisaemaerubescens(Wall.) Schott、异叶天南星ArisaemaheterophyllumBL.或东北天南星ArisaemaammrenseMaxim.的干燥块茎，因其有毒，临床用前常与生姜和白矾共同加工为制天南星，与生天南星相比除毒性降低，功效在消肿散结的基础上还可内服燥湿化痰，祛风止痉[1]，这与制天南星炮制过程中化学成分的变化有关。目前关于天南星炮制报道主要集中在刺激性成分草酸钙针晶类及凝集素蛋白的含量降低，2020年版《中国药典》规定天南星的含量检测为黄酮类，此外，文献报道[2-5]天南星还有生物碱类、核苷类、氨基酸类含氮化合物，多糖，针晶，凝集素等。本研究采用UPLC-UV法建立了天南星、制天南星提取物的紫外特征图谱，根据主要特征峰紫外信息，进一步采用UPLC-Q-TOF-MS/MS研究制天南星的化学成分，以期为天南星炮制及质量控制提供科学依据。
1.1仪器 Agilent 6540超高解析度四级杆-飞行时间质谱(安捷伦公司，美国)；
Waters ACQUITY H-Class超高效液相色谱仪(沃特斯公司，美国)；
超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2试药 生天南星从安国药材市场购买，经陕西中医药大学吴建华副教授鉴定为天南星科植物天南星Arisaemaerubescens(Wall.) Schott干燥块茎。制天南星为生天南星按2020年版《中国药典》规定方法，加白矾、生姜炮制而成。标本存放于陕西中医药大学药学院中药炮制技术传承基地中药饮片标本室。使用的甲醇、乙腈均为色谱纯，甲酸、提取用甲醇、乙醇均为分析纯，水为超纯水。
2.1样品制备
2.1.1醇提液的制备 分别取生天南星和制天南星粉末各约3 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇30 mL，密塞，称定重量，超声处理45 min，放冷，再称定重量，用60%乙醇补足减失重量，摇匀，离心，精密量取上清液18 mL，减压浓缩至干，加60%乙醇使之溶解，转移至5 mL量瓶中并定容，滤过，即得。生天南星醇提物和制天南星醇提物分别记做生醇和制醇。
2.1.2水提液的制备 分别取生天南星和制天南星粉末各约3 g，按“2.1.1醇提液制备”方法，将提取溶剂换为超纯水，即制备得水提液。生天南星水提物和制天南星水提物分别记做生水和制水。
2.2天南星炮制前后的UPLC特征图谱研究
2.2.1核苷、氨基酸等含氮类成分的UPLC特征图谱 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3，2.1×100 mm，1.8 μm；
流动相为乙腈(A)：
0.1%甲酸水(B)；
梯度洗脱(0～3.5 min，1%A；
3.5～10 min，5%A；
10～15 min，8%A；
15～28 min，8%A；
28～33 min，90%A；
33～36 min，90%A；
36～37 min，1%A；
37～42 min，1%A)；
进样量：3 μL；
流速：0.2 mL·min-1；
柱温度：35℃；
检测波长：二极管阵列检测器记录190～600 nm紫外光谱。
对生天南星与制天南星不同溶剂提取物核苷、氨基酸等含氮类成分进行分析(图1)，首先以生天南星水提物4个特征峰为研究对象，研究了生天南星类成分的紫外吸收特征，发现其紫外最大吸收波长有2个，分别为195.2～211.7 nm，248.4～261.4 nm(图2)。因此选择254 nm对生天南星与制天南星不同溶剂提取物核苷、氨基酸等含氮类成分的UPLC特征图谱进行研究。结果发现，以水作为提取溶剂提取生天南星与制天南星中的核苷、氨基酸等含氮类成分提取效率比以60%的乙醇更高，同时也发现，生天南星与其炮制品制天南星的特征图谱有所差异，因此后续在研究天南星炮制前后核苷、氨基酸等含氮类成分时，以水提物作为研究对象。
A.生水;B.制水;C.生醇;D.制醇
图2 生天南星水提物峰1～4紫外最大吸收图
2.2.2黄酮类成分的UPLC特征图谱 色谱柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3，2.1×100 mm，1.8 μm；
流动相为乙腈(A)：
0.1%甲酸水(B)；
梯度洗脱(0～3.5 min，5%A；
3.5～4 min，11.2%A；
4～26 min，11.2%A；
26～27 min，18%A；
27～32 min，18%A；
32～33 min，90%A；
33～35 min，90%A；
35～36 min，5%A；
36～42 min，5%A)；
进样量：3 μL；
流速：0.3 mL·min-1；
柱温度：35 ℃；
检测波长：二极管阵列检测器记录190～600 nm紫外光谱。
对生天南星与制天南星不同溶剂提取物黄酮类成分进行分析(图3)，首先以生天南星水提物10个特征峰为研究对象，研究了生天南星黄酮类成分的紫外吸收特征，发现峰1～10共有的紫外最大吸收波长有2个，分别为268.5～270.9 nm，334.2～349.2 nm(图4)。选择335 nm对生天南星与制天南星不同溶剂提取物黄酮类成分的UPLC特征图谱进行研究。结果发现，生天南星与制天南星的紫外色谱行为基本一致，但水提物样品显示更多的信息峰，因此后续在研究天南星中黄酮类成分时，以生天南星水提物作为研究对象(图4)。
A.生水;B.制水;C.生醇;D.制醇
图4 天南星水提物峰1～10紫外最大吸收图
2.3天南星炮制前后的UPLC-Q-TOF-MS特征图谱研究 带鞘流气的电喷雾离子源(AJS-ESI)，电离模式(ESI+、ESI-)，扫描方式采用target msms，雾化气温度325℃，气体流量8 L·min-1，喷雾压力40 psi，鞘流气温度350℃，鞘流气流量11 L·min-1，毛细管电压4000 V。二级质谱分析条件：碰撞能量为：0～50 V；
全扫描质谱范围：100～1200 m/z。
2.3.1生天南星水提物含氮类成分UPLC-Q-TOF-MS分析 运用正离子分析模式对生天南星水提物进行UPLC-Q-TOF-MS检测(总离子流图见图5)，从一级质谱中共检索到8个化合物，并根据其分子质量及分子式推测了其对应的化合物，具体结果见表1。
表1 生天南星水提物含氮类成分MS分析检索结果
2.3.2制天南星水提物含氮类成分UPLC-Q-TOF-MS分析 运用正离子分析模式对制天南星水提物进行UPLC-Q-TOF-MS检测(总离子流图见图6)，从一级质谱中共检索到4个化合物，并根据其分子质量及分子式推测了其对应的化合物，具体结果见表2。
图5 生天南星水提物含氮类成分总离子流图
图6 制天南星水提物含氮类成分总离子流图
表2 制天南星水提物含氮类成分MS分析检索结果
峰1：保留时间8.456 min，一级质谱m/z268.1057 [M+H]+，二级质谱图分给出产物离子峰m/z136.0631，119.0353，一级质谱信息和二级质谱信息与腺苷基本一致，并且符合腺苷的裂解规律[6]。推断峰1为腺苷。
峰2：保留时间9.252 min，一级质谱m/z284.0992 [M+H]+，二级质谱图分给出产物离子峰m/z152.0575，一级质谱信息和二级质谱信息与鸟苷基本一致，并且符合鸟苷的裂解规律[7]。推断峰2为鸟苷。
峰3：保留时间9.970 min，一级质谱m/z166.0865 [M+H]+，二级质谱图分给出产物离子峰m/z120.0815，一级质谱信息和二级质谱信息与苯丙氨酸基本一致，并且符合苯丙氨酸的裂解规律[8]。推断峰3为苯丙氨酸。
峰5：保留时间16.016 min，一级质谱m/z205.0971 [M+H]+，二级质谱图分给出产物离子峰m/z188.0723、146.0606、118.0658，一级质谱信息和二级质谱信息与色氨酸基本一致，并且符合色氨酸的裂解规律[9]。推断峰5为色氨酸。
峰8：保留时间24.873 min，一级质谱m/z302.2080 [M+H]+，二级质谱图分别给出产物离子峰m/z171.1138，143.1189，72.0813。推断峰8为L-Leucine,L-alanyl-L-valyl-(CAS：93414-38-1)。
2.3.3制天南星水提物黄酮类成分UPLC-Q-TOF-MS分析 运用负离子分析模式对制天南星水提物进行UPLC-Q-TOF-MS检测(总离子流图见图7)，从一级质谱中共检索到12个化合物，具体结果见表3。
图7 制天南星水提物黄酮类成分总离子流图
表3 制天南星水提物黄酮类成分MS分析检索结果
黄酮类化合物的共同特征：在负离子模式下，各种黄酮类化合物的MS2数据显示一系列的m/z503 [M-H-60]-、473 [M-H-90]-、443 [M-H-120]-碎片离子，这些离子为黄酮碳苷类化合物的特征碎片离子，且该类化合物应为双糖取代的黄酮碳苷，分子量为564的化合物可能为芹菜素-6-C-戊糖-8-C-葡萄糖苷或者芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C戊糖苷，分子量为594的化合物可能为芹菜素-6,8-二葡萄糖苷或者芹菜素-6,8-二半乳糖苷。杜树山等[10]从天南星中发现了以芹菜素为母核，分子量为564的黄酮碳苷类化合物5个：夏佛托苷、异夏佛托苷、芹菜素-6-半乳糖-8-阿拉伯糖苷、芹菜素-6-阿拉伯糖-8-半乳糖苷、维采宁-3(芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷)；
以芹菜素为母核，分子量为594的黄酮碳苷类化合物2个：维采宁-2(芹菜素6,8-C-二吡喃葡萄糖苷)、芹菜素6,8-C-二吡喃半乳糖苷。结合本研究一级、二级质谱信息，推测天南星黄酮类化合物的特征图谱中可能含有以上化合物。本实验以夏佛托苷、异夏佛托苷和维采宁-2、维采宁-3为对照品，通过保留时间比对，发现峰1、4分别与维采宁-2、夏佛托苷保留时间一致，异夏佛托苷、维采宁-3保留时间相同，与峰12一致。
1号峰：保留时间12.200 min，一级质谱m/z为581.1490 [M+H]+，二级质谱显示特征碎片离子519.0987 [M-H-60]-、489 [M-H-90]-、459.0856 [M-H-120]-、441.0728[M-H-120-18]、399.0662 [M-H-120-60]-、369.0568 [M-H-120-90]-、327.0436 [M-H-120-90-42]-，特征碎片离子与木犀草素-6-C-葡萄糖-8-C-木糖极度相似[11]。另外，根据文献报道，489 [M-H-90]-由化合物中木糖0-2键断裂(0,2[XP]-)，相对丰度为27.41%，459.0856 [M-H-120]-由化合物中葡萄糖0-2键的断裂(0,2[XG]-)，相对丰度为75.08%。根据文献报道，C-6的糖基更容易碎裂，因此证明了化合物6位连接葡萄糖，而8位连接木糖的结构。综上所述，1号峰推测为木犀草素-6-C-葡萄糖-8-C-木糖。
4号、12号峰：保留时间分别为19.634、28.544 min，一级质谱m/z分别为565.1541 [M+H]+、565.1538 [M+H]+，4号峰根据保留时间初步判断为夏佛托苷(芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷)，二级特征碎片离子457 [M+H-90-18)]+、427 [M+H-120-18)]+，其中[M+H-90-18)]+来源于化合物失去一分子水后，C-8阿拉伯糖0-2键的断裂(0,2[XP]-)；
[M+H-120-18)]+来源于化合物失去一分子水后，C-6葡萄糖0-2键的断裂(0,2[XG]-)。MS2显示[M+H-120-18)]+丰度远高于[M+H-90-18)]+，文献报道，C-6的糖基更容易碎裂[12]，因此MS2特征碎片证实了4号峰为异夏佛托苷。而在12号峰中，[M+H-120-18)]+丰度远低于[M+H-90-18)]+，说明该化合物C-6位为阿拉伯糖，是一个戊糖，而维采宁-3的C-6位应为一个己糖，因此证明12号峰为异夏佛托苷而不是维采宁-3。
表4 制天南星水提物黄酮类成分MS2分析结果
7号、11号峰：保留时间分别为19.634、28.544 min，正离子模式下一级质谱m/z分别为595.1638[M+H]+、595.1642 [M+H]+，负离子模式下进行MS2分析，母离子分别为593.1436 [M-H]-、593.1420 [M-H]-，说明2个化合物的分子量均为594，符合芹菜素(270)+葡萄糖基(162)或半乳糖基(162)+葡萄糖基(162)或半乳糖基(162)的分子量。说明7、11号峰可能为芹菜素-6,8-二葡萄糖苷或者芹菜素-6,8-二半乳糖苷。7号峰的特征碎片离子575[M-H-18]-、473.1018[M-H-120]-、383.0734[M-H-210]-(芹菜素[M:270]+糖残基[M:113])、354.0695[M-H-239](芹菜素[M:270]+糖残基[M:84])与文献报道中的芹菜素-6,8-二葡萄糖苷特征碎片一致[13].，而11号峰的特征碎片为503.1107、473.0968、383.073，未出现575[M-H-18]-、354[M-H-239]特征碎片，因此推测7号峰为芹菜素-6,8-二葡萄糖苷、11号峰为芹菜素-6,8-二半乳糖苷。
2、3、5、6、8、9、10号峰：保留时间分别为16.404、19.221、20.226、22.177、23.175、24.045 min，正离子模式下一级质谱分子量为565.1539、565.1541、565.1541、595.1638、565.1545负离子模式下进行MS2分析，母离子分别为563.1320 [M-H]-、563.1329 [M-H]-、563.1324 [M-H]-、563.0300 [M-H]-、563.1341 [M-H]-、563.1333 [M-H]-。说明3、5、6、8、9、10号峰的分子量均为564。符合芹菜素(270)+戊糖基(162)+己糖基(132)的分子量。根据前期文献研究，推测6个峰对应的化合物结构为芹菜素-6-己糖-8-戊糖或者芹菜素-6-戊糖-8-己糖苷，戊糖为木糖、阿拉伯糖可能性更高，己糖为半乳糖、葡萄糖的可能性更高。MS2分析时，发现6个峰共有5个特征碎片离子，503 [M-H-60]-、473 [M-H-90]-、443 [M-H-120]-、383 [M-H-90-90]-、353 [M-H-120-90]-，503、473均为戊糖基碎裂的结果[12,14]，文献报道C-6位糖基更容易碎裂，峰5、8、9、10的特征碎片503 [M-H-60]-相对丰度均小于10%，相反的，峰2、3、6的特征碎片503 [M-H-60]-均大于10%，因此推测峰5、8、9、10可能为芹菜素-6-葡萄糖(半乳糖)-8-阿拉伯糖(木糖)苷，而峰2、3、6可能为芹菜素-6-阿拉伯糖(木糖)-8-葡萄糖(半乳糖)苷。
本研究发现，天南星中的主要化学成分以核苷、氨基酸等含氮类和黄酮类为主，这与文献报道基本一致[2,15]，其中苯丙氨酸、色氨酸等氨基酸和腺苷、鸟苷等腺苷类成分及黄酮类成分易溶于热水，因此制备样品的提取方法选择为水提法。与天南星生品相比，制天南星其特征图谱显示化学成分在种类及含量上均不如生品丰富；
黄酮类成分种类与生品几乎一致，但相应成分的含量比生品更少。《中国药典》2020年版规定：制天南星在炮制加工过程中需加水和白矾反复浸泡，待浸泡至口尝微有麻舌感时，再加生姜、白矾与天南星共同煮沸至无干心。结合本研究关于生天南星和制天南星的水提物以及醇提物的UPLC特征图谱研究结果，可以推测长时间的水处理导致天南星中的水溶性化学成分在炮制过后发生了损失，至于是否转化生成了新成分还需进一步研究。
本研究在对天南星中的黄酮类成分进行MS和MS2分析时，发现天南星中的黄酮类成分均有明显的特征，其母核以芹菜素为主，大部分黄酮类成分均为以芹菜素为母核的二糖苷，取代位置可能以C-6位和C-8位为主。取代糖的种类以戊糖和己糖为主，并且其裂解规律符合文献报道[16]，在正离子模式下，其裂解时易脱水，因此碎片[M+H-H2O]-、[M+H-2H2O]-、[M+H-3H2O]-为该类化合物在正离子模式下的共同特征峰。另外根据文献报道，负离子模式下，黄酮碳苷MS2模式下以糖基的碎裂为主，本研究黄酮碳苷化合物的碎裂符合其特征[12]，其特征碎片以[M-H-60]-m/z503、[M-H-90]-m/z473、[M-H-120]-m/z443为主，[M-H-60]-来源于分子中五碳糖的碎裂，[M-H-120]-来源于分子中六碳糖的碎裂，[M-H-90]-为五碳糖或六碳糖碎裂的结果。由于二糖取代的黄酮碳苷其C-6的糖基比C-8位的糖基更容易碎裂，因此，当C-6位为六碳糖取代时，[M-H-60]-m/z503的相对丰度应该比当C-6位为五碳糖取代时的相对丰度低。本研究发现天南星中存在大量的同分异构体，仅分子式为C26H28O14，未知结构的同分异构体就有7个，虽然该类化合物在MS2分析时有丰度差异，可以判断C-6位连接五碳糖还是六碳糖，但无法进一步确定糖的种类，因此后续可能需要借助核磁共振等波谱解析手段对该类化合物进行结构鉴定。
其次在天南星药材中检测到了仲丁威和环草定，其中仲丁威是一种氨基甲酸酯类杀虫剂，环草定是一种选择性尿嘧啶取代的除草剂，这两种成分应为天南星种植时，为减少病虫草害等造成的损失，人为使用农药后的残留。《中国药典》2020年版在0212通则中收录了药材及饮片(植物类)33种禁用农药，规定不得检出(不得超过定量限)。虽然这两种农药不在规定的范围内，但仍提醒我们应重视中药材种植时农药的使用合理性问题。
中药炮制的核心目的是减毒增效，其中围绕毒性药的目的主要体现在降低毒性的前提下尽可能保留药效。天南星为典型的毒性中药，也是卫生部规定的28种毒性中药之一，其毒性成分较为统一认识为草酸钙针晶及其附着的毒蛋白和多糖形成的“毒针晶”，但此类成分不溶于水，白矾溶液的处理就可以大量破坏此类成分[17]，而2020年版《中国药典》规定的有效成分黄酮类及文献报道的核苷、氨基酸等含氮类和多糖类在炮制过程中长时间浸泡和煎煮会造成此类成分的流失[18-19]，因此有必要通过研究其炮制过程成分变化规范炮制工艺，提高饮片质量。
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