邵淑贤， 陈潇敏， 林燕萍， 方德音， 蔡捷英，王金焕， 林馨颖， 金 珊， 叶乃兴*
（1.福建农林大学 园艺学院，福建 福州 350002；
2.武夷学院 茶与食品学院，福建 武夷山 354300；
3.云霄县茶叶科学研究所，福建 云霄 363300）
乌龙茶作为我国第3大茶类，主要产区集中于我国闽北地区、闽南地区、广东及台湾地区等地，如武夷岩茶、铁观音、凤凰单丛和东方美人等[1]。由于茶树品种、产地和加工工艺等诸多因素，各种乌龙茶形成了独特的滋味品质[2-3]。滋味作为评价茶叶品质的重要因素之一，受到茶汤中的氨基酸、黄酮类、茶多酚和生物碱等呈味物质的综合影响[4]。茶叶具有明显的地域特色和品质特征，其市场认可度和消费者喜爱程度也各有不同，近年来茶叶区域品牌建设越来越受到人们重视，因此对不同产地茶叶滋味品质特征的研究具有一定的研究意义和价值。
液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的广泛靶向代谢组学是一种高通量检测与数据多元统计分析相结合的快速、可靠的方法，可用于检测经济作物，如枸杞[5]、枇杷[6]、柚子[7]和茶[8]等的多种代谢物。近年来，基于代谢组学对茶叶化学品质特征的相关研究也成为茶叶研究热点之一，杨晨等采用UHPLC-QTOF/MS对不同产地普洱生茶的非挥发性代谢物进行分析，发现不同产地普洱生茶的化学成分具有明显产地特征[9]。邱晓红等利用儿茶素组分和生物碱含量来区分福建不同产地水仙茶，认为福建水仙茶滋味特征的形成与产地密切相关[10]。林洁鑫等采用UPLC-MS/MS对两地红茶的代谢产物进行比较，发现两地红茶具有不同的呈味特点[11]。前人这些研究阐明了不同产地、品种茶间的品质差异，但多从产地和品种的角度解释差异，而等级对茶叶品质的影响不可忽视[12-13]。目前，对于乌龙茶品质和等级与产地之间的关系鲜有报道。
黄观音是福建省农业科学院茶叶研究所从铁观音（母本）和黄旦（父本）人工杂交F1代中单株选育成的高香型国家级优良茶树品种[14]。黄观音是福建省的主栽品种，并在全国广泛种植。以黄观音鲜叶为原料制成的乌龙茶品质优异，滋味醇厚甘爽，香气特征趋向父本，具有“通天香”[14]。近年来，黄观音在云霄、武夷山等地大面积种植，云霄黄观音品质优异，独具“花香蜜韵”，云霄县已将“云霄黄观音”打造成茶叶公共品牌。武夷山作为乌龙茶的发源地，在茶叶发展史上具有重要地位[15]。因此，为更全面地了解不同产地对黄观音乌龙茶品质的影响，选取云霄黄观音和武夷黄观音乌龙茶样品，应用广泛靶向代谢组学技术对其主要呈味物质进行比较分析，探究两地黄观音乌龙茶的品质差异。
1材 料与方法
1.1 材料与试剂
供试样品为2020年春季黄观音乌龙茶。云霄黄观音乌龙茶由云霄县茶叶科学研究所提供（10份市售代表性茶样），武夷黄观音乌龙茶由武夷学院茶与食品学院提供（10份市售代表性茶样）。
甲醇、乙腈（均为色谱纯）：上海默克化工技术有限公司产品；
色谱纯标准品：BioBioPha公司和Sigma-Aldrich公司产品。
1.2 实验仪器
5424R 2 Eppendorf离心机：艾本德中国有限公司产品；
MM 400研磨机：德国Retsch公司产品；
Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A超高效液相色谱：日本岛津公司产品；
Applied Biosystems 6500 QTRAP三重四级杆质谱仪：美国赛默飞世尔科技公司产品；
SB-C18色谱柱：美国安捷伦公司产品。
1.3 实验方法
1.3.1 茶叶感官审评方法由5位国家一级评茶师作为审评专家，根据GB/T23776—2018《茶叶感官审评方法》中的乌龙茶盖碗审评法进行审评，以标准中5项因子的综合评分作为样品等级的判定依据，对样品的外形、香气、汤色、滋味和叶底进行评价。从20个黄观音乌龙茶样品中筛选出具有两地代表性的茶样，综合评分大于90分的样品评定为一级，低于90分且高于80分的样品判定为二级。
1.3.2 代谢组学测定方法
1）样品前处理 利用研磨仪将茶样研磨（30 Hz、1.5 min）至粉末状，称取0.1 g茶粉溶解于1.2 mL 70%（体积分数）甲醇提取液中；
提取液每30 min涡旋一次，持续30 s，涡旋6次以提高提取率；
涡旋后将样品置于4℃冰箱，过夜；
离心（12000 r/min、10 min）后吸取上清液，用微孔滤膜（0.22 μm）过滤样品，并保存于进样瓶中，用于后续LC-MS/MS分析。
2）LC-MS/MS分析条件 利用超高效液相色谱（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）和串联质谱（tandem mass spectrometry，MS/MS）数据采集仪器系统对物质进行鉴定。
色谱条件：色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；
流动相：A相为超纯水（加入体积分数0.1%的甲酸），B相为乙腈（加入体积分数0.1%的甲酸）；
洗脱梯度：0 min，B相体积分数为5%；
9 min内B相体积分数线性增加到95%，并在95%维持1 min；
10～11.1 min，B相体积分数降为5%，并以5%平衡至14 min；
柱温：40℃；
进样量：4 μL；
流量：0.35 mL/min。
质谱条件：电喷雾离子源（ESI），温度550℃；
正离子模式质谱电压5500 V，负离子模式质谱电压-4500 V；
离子源气体I（GS I）、气体II（GS II）和帘气 （CUR）分 别 设 置 为0.3447、0.4137、0.1723 MPa，碰撞诱导电离（CAD）参数设置为高；
碰撞气体（氮气）设置为中等，三重四级杆（triple quadrupole，QQQ）扫描使用MRM模式；
在QQQ中，每个离子对根据优化的去簇电压（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）进行扫描检测。
1.4 数据分析
参考Wang等的方法[16]，基于碎片模式、保留时间、m/z与迈维 （武汉）生物技术有限公司自建MVDB V2.0数据库和公共数据库的标准对物质进行定性，代谢物定量利用多反应监测模式分析。获得不同样本的代谢物质谱后，对物质质谱峰的峰面积进行积分，同时对不同样品中同一代谢物的质谱峰进行积分校正，利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据。对鉴定的代谢物进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析 （orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）。基于OPLS-DA模型获得的变量重要性投影（variable importance in project，VIP）进行评分，根据VIP≥1、Fold Change≥2或Fold Change≤0.5筛选出的代谢物定义为差异代谢物（significant changed metabolites，SCMs）。利用KEGG代谢库将鉴定出的差异代谢物进行比对并注释[17]，进行相关代谢通路的分析。
2.1 云霄黄观音与武夷黄观音感官品质分析
对不同产地黄观音乌龙茶的外形、汤色、香气、滋味和叶底进行感官审评，一级综合评分均高于90分，二级综合评分均高于80分，审评结果见表1。结果表明，云霄黄观音乌龙茶滋味多以浓醇为主，武夷黄观音乌龙茶滋味多以浓厚为主。根据两地黄观音乌龙茶的感官审评滋味特点和品质得分，确定待测样品为YX1、YX2、WY1和WY2（见图1）。样品中，两地一级黄观音乌龙茶滋味均具有鲜味和花蜜香特征。
图1 不同产地黄观音乌龙茶的外形、汤色和叶底Fig.1 Shape,soup and infused leaves of Huang Guanyin oolong tea from different areas
表1 20份黄观音乌龙茶感官审评结果Table 1 Sensory evaluation results of 20 samples of Huang Guanyin oolong tea from different areas
2.2 不同产地黄观音乌龙茶广泛靶向代谢组学分析
为研究不同产地黄观音乌龙茶间的滋味差异，对武夷山和云霄县各两个等级的黄观音乌龙茶进行广泛靶向的LC-MS/MS代谢谱分析。共测出11类820种代谢产物，其中包括大量可能影响茶汤滋味的代谢产物，包括黄酮类、氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、生物碱、有机酸以及其他初级和次级代谢产物。
2.3 不同产地黄观音乌龙茶的相关性分析
对这些共有代谢物进行PCA发现，同等级不同产地的样品之间被明显地区分开来，显著性为0.01（见图2（a））。为消除数量对模式识别的影响，对每个代谢物的峰面积进行对数转换，随后进行层次聚类分析（见图2（b）），发现两个等级的黄观音乌龙茶属于不同的类群。主成分分析和聚类分析结果表明，不同产地及等级的黄观音乌龙茶具有不同的代谢特征。
图2 黄观音乌龙茶代谢物的PCA图和聚类热图Fig.2 PCA score plot and clustering heatmap of metabolites from Huang Guanyin oolong tea
为了鉴别出具体有哪些差异代谢物造成了分离现象，建立2组同等级不同产地黄观音乌龙茶OPLS-DA模型，表2为模型评价参数。OPLS-DA结合正交信号矫正（OSC）和偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）方法，通过去除不相关的差异来筛选差异变量。在这2组模型中R2Y和Q2的值均大于0.9，说明这2组模型构建良好，该样本预测性可靠。
表2 OPLS-DA的参数Table 2 Parameters of OPLS-DA analysis
2.4 不同产地黄观音乌龙茶差异代谢物的分析
2.4.1 差异代谢物的筛选为了鉴定不同产地黄观音乌龙茶差异代谢物的特点，通过OPLS-DA模型，根据VIP≥1、上调代谢物Fold Change≥2和下调代谢物Fold Change≤0.5筛选出显著差异代谢物。鉴定出同等级的两地黄观音乌龙茶分别存在63种和120种差异代谢物，这些代谢物可分为不同类别，主要包括氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、酚酸类、黄酮类、萜类、鞣质、有机酸和脂质等（见图3）。整体上不同产地的一级黄观音乌龙茶差异代谢成分（63种）占共有代谢成分（820种）的7.68%，二级黄观音乌龙茶差异代谢成分（120种）占共有代谢成分（820种）的14.63%，说明同等级不同产地的黄观音乌龙茶代谢物质存在差异。
图3 不同产地黄观音乌龙茶差异代谢物Fig.3 Differential metabolites in Huang Guanyin oolong tea from different areas
与同等级的云霄黄观音相比，武夷黄观音有更多的差异代谢物呈上调趋势，WY1有50种差异代谢产物呈上调趋势，占两地一级黄观音总差异代谢物的79.37%；
WY2有78种差异代谢物呈上调趋势，占两地二级黄观音总差异代谢物的65.00%。
2.4.2 差异代谢物KEGG富集分析通过KEGG数据库将差异代谢物进行通路富集分析。一级和二级黄观音乌龙茶中鉴定出来的63种和120种显著差异代谢物主要分布在20条代谢途径中（见图4）。两地一级黄观音差异代谢物富集程度最高的前5条通路分别是：异黄酮生物合成、黄酮类生物合成、黄酮和黄酮醇的生物合成、单萜生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢；
两地二级黄观音差异代谢物富集程度最高的前5条通路分别是：α-亚麻酸代谢，烟酸和烟酰胺代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，壬烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成，β-丙氨酸代谢。
图4 差异代谢物KEGG富集图Fig.4 KEGG enrichment map of differential metabolites
两地一级黄观音差异代谢物在KEGG数据库注释的途径中，存在7条与两地一级黄观音品质相关的代谢途径（见图4），包括17种关键的显著差异代谢物（见图5）。其中，差异代谢物富集程度最高的前5条通路中有3条通路与11种黄酮类差异代谢物相关，包括异黄酮生物合成、黄酮类生物合成、黄酮和黄酮醇的生物合成。柚皮素查尔酮作为黄酮类物质合成途径中必不可少的前体物质，在武夷黄观音中显著上调2.81倍。柚皮素和芹菜素作为这3条代谢途径共有的差异代谢物，在武夷黄观音中分别显著上调2.90倍和2.64倍。山柰酚是异黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成的共有差异代谢物，在武夷黄观音中显著上调2.26倍。异黄酮生物合成途径中所注释的差异代谢物上调倍数均在2.00倍以上，如香橙素、柚皮素查尔酮、圣草酚、山柰酚和根皮素。黄酮及黄酮醇的生物合成通路中槲皮素-3-O-桑布双糖苷在武夷黄观音中上调达到7.49倍，Li等研究表明槲皮素-3-O-桑布双糖苷具有促进神经中枢兴奋的作用，认为武夷黄观音可能更具有促进兴奋的作用[18]。硫是植物生长发育所需的大量营养元素之一[19]，半胱氨酸和蛋氨酸的代谢通路与含硫有机物合成相关，在这一途径中的O-乙酰丝氨酸在云霄黄观音中显著上调2.79倍。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路中L-天冬酰胺在武夷黄观音中显著上调2.39倍，γ-氨基丁酸作为这两条代谢通路中必不可少的物质，在武夷黄观音中显著上调3.14倍。Liao等研究表明γ-氨基丁酸作为一种信号分子，被认为是茶树碳氮代谢的交汇点[20]。Ren等认为γ-氨基丁酸多与类黄酮代谢中酶活性成正相关，可能作为信号分子参与黄酮类化合物代谢的调节[21]。
图5 两地一级黄观音乌龙茶关键差异代谢物的代谢途径Fig.5 Metabolic pathways of the key differential metabolites of first-grade Huang Guanyin oolong tea from different areas
两地二级黄观音差异代谢物在KEGG数据库注释的途径中，存在5条与两地二级黄观音品质相关的代谢途径（见图4），包括13种关键的显著差异代谢物（见图6）。其中，差异代谢物富集程度最高的前5条通路中有2条与氨基酸类物质合成相关的代谢途径，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及β-丙氨酸代谢。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路中的L-天冬酰胺、L-谷氨酸和草酰乙酸均在武夷黄观音中显著上调，值得注意的是，L-天冬酰胺显著上调5.10倍。烟酸和烟酰胺代谢途径中鉴定出5种差异代谢物，其中，具有一定保健功效的烟酸在云霄黄观音中显著上调2.20倍。乙醛酸和二羧酸代谢通路中鉴定出3种差异代谢物，酪胺在云霄黄观音中显著上调2.25倍，该物质存在于发酵茶中[22]。
图6 两地二级黄观音乌龙茶关键差异代谢物的代谢途径Fig.6 Metabolic pathways of the key differential metabolites of second-grade Huang Guanyin oolong tea from different areas
2.4.3 主要滋味成分比较根据差异代谢物KEGG的富集通路分析结果，把研究重点放在可能对两地黄观音乌龙茶滋味产生影响的差异代谢物上，如黄酮类、氨基酸及其衍生物类。
在两地一级黄观音乌龙茶中，基于Fold Change（FC）和VIP值，鉴定出18种黄酮类差异代谢物和7种氨基酸及其衍生物类差异代谢物（见图7（a）、7（b））。涩味是形成乌龙茶特有滋味的重要因素之一[23]，黄酮类物质对茶汤的苦涩味有一定贡献[24]。一级武夷黄观音中含有较丰富的黄酮醇糖苷及其前体物质，如香橙素、柚皮素、柚皮素查尔酮、圣草酚、山柰酚、根皮素、槲皮素-3-O-桑布双糖苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷和芹菜素-7-O-芸香糖苷等。杨梅素、槲皮素和山柰酚是茶叶中常见的黄酮醇类，其不同的苷元与糖基结合形成了不同的黄酮醇糖苷。黄酮苷类物质阈值极低，呈味特征是较柔和的涩感[4]。前人研究发现黄酮醇糖苷对咖啡因的苦味有增强作用[25]，黄酮醇糖苷类物质含量低，则滋味醇和，反之则苦涩[26]。游离氨基酸作为茶汤鲜味的主要贡献成分，对茶叶品质有重要贡献[27-28]。两地一级黄观音中L-脯氨酸、L-天冬酰胺和γ-氨基丁酸被鉴定为差异代谢物，且均在武夷黄观音中呈上调趋势。L-脯氨酸和L-天冬酰胺是茶叶中直接影响茶汤鲜爽度和口感的鲜味氨基酸[28-29]。γ-氨基丁酸作为茶叶中的非蛋白质游离氨基酸，对收敛性涩味有贡献[28]。Ren等研究表明γ-氨基丁酸可能参与黄酮类化合物代谢的调节[21]。这些差异物质可能对两地黄观音乌龙茶的滋味形成具有一定贡献，其中黄酮类物质可能对区分两地一级黄观音乌龙茶的滋味特征具有积极作用。
在两地二级黄观音乌龙茶中，基于FC和VIP值，鉴定出11种黄酮类差异代谢物和14种氨基酸及其衍生物类差异代谢物（见图7（c）、7（d））。其中3种游离氨基酸被鉴定为差异代谢物，包括L-谷氨酸、L-天冬酰胺和γ-氨基丁酸，它们均在武夷黄观音中呈上调趋势。相比于一级黄观音，具有鲜味特征的游离氨基酸在二级黄观音乌龙茶中含量较低。二级武夷黄观音中也含有较丰富的黄酮类差异代谢物，如异鼠李素-3-O-芸香糖苷、表茶黄酸-3-O-没食子酸等，但作为黄酮醇糖苷前体物质的杨梅素，在二级云霄黄观音中显著上调2.58倍。两地二级黄观音的20条主要KEGG富集通路中没有发现与黄酮类物质相关的代谢通路。但黄酮苷类物质阈值极低，前人研究表明黄酮苷类物质可与其他物质相互作用，从而对茶叶滋味品质产生影响[26，30]。二级黄观音中的黄酮糖苷类物质含量更高，其可能与茶叶滋味品质呈负相关[30]。
对比不同产地及等级黄观音乌龙茶的呈味物质发现，云霄黄观音乌龙茶呈苦涩味的黄酮糖苷类物质含量较低，可能是其滋味具有醇和特征的原因[26]，而武夷黄观音滋味醇厚的原因也可能是具有丰富的黄酮糖苷类和氨基酸类物质。一级黄观音乌龙茶滋味更具鲜爽特征，可能与其含有丰富的氨基酸类物质密不可分，这与前人的研究结果一致[12]。不同产地黄观音乌龙茶在黄酮类物质和氨基酸含量上的差异可能也与不同的加工工艺相关，Liu等研究表明随着半发酵时间的延长，乌龙茶中黄酮醇或黄酮糖苷类物质含量有所增加[31]，氨基酸的含量在加工过程中也会发生变化[32]。
采用UPLC-MS/MS技术，对同等级不同产地的黄观音乌龙茶非挥发性物质进行比较分析。结果表明，不同产地黄观音乌龙茶的非挥发性物质含量具有较大差异，呈味物质含量在分布上具有明显的产地特征。其中，两地一级黄观音乌龙茶差异代谢成分（10类63种）和两地二级黄观音乌龙茶差异代谢成分（11类120种）分别占共有代谢成分（11类820种）的7.68%和14.63%。KEGG代谢通路分析发现，两地一级黄观音差异代谢物在黄酮类和氨基酸及其衍生物相关代谢通路的富集程度较高，两地二级黄观音差异代谢物在氨基酸及其衍生物、烟酸和烟酰胺代谢通路的富集程度较高。基于FC与VIP值，进一步筛选到与滋味品质相关的槲皮素-3-O-桑布双糖苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-芸香糖苷、L-脯氨酸、L-天冬酰胺和γ-氨基丁酸等代谢物，且含量在两地一级黄观音中的差异达到显著水平；
L-谷氨酸、L-天冬酰胺和γ-氨基丁酸等差异代谢物含量在两地二级黄观音中的差异达到显著水平。通过对影响两地同等级黄观音乌龙茶滋味品质的代谢物进行比较，有利于弥补茶叶产地鉴别通常依赖感官判定的不足，为辨别云霄黄观音与武夷黄观音乌龙茶提供理论参考。由于不同产地及等级黄观音乌龙茶的滋味品质还可能受到其他因素的影响，还需进一步控制变量并增加样本，同时课题组在后续研究中，将结合电子鼻、电子舌和近红外光谱等技术，为云霄黄观音和武夷黄观音乌龙茶的品质评定提供客观依据。