林颖，倪乐艺，余河杰，胡婷婷，蔡振寨，林李淼
1.台州市第一人民医院 消化内科，浙江 台州 318020；
2.温州医科大学附属第二医院 消化内科，浙江 温州 325088；
3.温州医科大学附属第一医院 消化内科，浙江 温州 325015
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是最常见的实体瘤之一。根据2018年全球癌症统计报告，肺癌和乳腺癌是最常见的癌症（11.6%），其次是CRC（10.2%），而病死率最高的癌症是肺癌（18.4%）、CRC（9.2%）和胃癌（8.2%）[1]。WHO估计，到2030年，新诊断的CRC病例和与CRC相关的死亡人数将分别增加到77%和80%[2]。目前，手术联合术后化疗被认为是CRC的标准治疗方法。然而，不良反应和耐药性限制了CRC患者化疗的使用[3-4]。癌基因的激活或抑癌基因的失活引发或加速恶性肿瘤的进程[5]。随着测序技术的发展，CRC的靶向药物治疗越来越受到研究者的关注[6-7]。然而，到目前为止，尚未在CRC中发现成熟、明确的分子机制或预后指标。
K12基因位于染色体17q25上CD7基因上游，经人类基因图谱研讨会（Human Gene Mapping Workshops, HGMW）批准命名为分泌型跨膜蛋白1（secreted and transmembrane 1, SECTM1）[8-10]。该基因全长14 kb，编码在外周血白细胞和乳腺癌细胞系中检测到的最显著的1.8 kb mRNA[10]。转染SECTM1基因的细胞表面可以检测到SECTM1，未转染的细胞中尚未发现[10-11]。SECTM1是一种广泛表达的INF诱导分子，作为T细胞激活的有效共刺激配体，与抗CD28抗体协同作用[12]。例如，SECTM1可作为T细胞的共刺激因子，受干扰素α（interferon-α,IFN-α）和IFN-γ的调控，在黑色素瘤细胞中表达显著上调[12]。SECTM1也与肿瘤进展和转移有关，在乳腺癌、前列腺癌细胞系和部分髓系白血病细胞中高表达[10-12]。然而，SECTM1表达在CRC中的生物学意义尚不清楚。本研究拟分析SECTM1表达与CRC的相关性以及SECTM1的生物学功能。
1.1 材料
1.1.1 主要材料和仪器：CEA-RIA试剂盒购自上海起发实验试剂有限公司；
抗SECTM1抗体（AB106377）购自美国Abcam公司；
山羊抗兔IgG、3，5-二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）购自北京中山生物有限公司；
6种人CRC细胞系（HCT116、RKO、Caco-2、HT-29、DLD-1和HCT-8）和正常人结肠上皮细胞系（NCM460）购自中国科学院上海细胞库；
RPMI1640培养基购自美国Thermo Fisher Scientific公司；
10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）购自美国Atlanta Biologicals Lawrenceville公司；
GV367慢病毒载体购自上海吉凯基因化工科技有限公司；
特异性慢病毒和阴性对照（negative control, NC）慢病毒包装质粒购自上海捷恩生物科技有限公司；
Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；
荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司；
TRIzol购自上海普菲生物科技有限公司；
Promega M-MLV试剂盒购自北京普罗梅加生物有限公司；
SYBR Master Mixture购自北京宝日医生物技术有限公司；
qRTPCR仪购自上海罗氏诊断产品有限公司；
Western blot曝光仪购自广州博鹭腾生物科技有限公司；
流式细胞仪分析购自北京安诺伦生物科技有限公司。
1.1.2 临床资料：收集2011年至2017年温州医科大学附属第二医院370份CRC和癌旁组织样本。纳入标准：均接受手术，经活检及病理诊断CRC。排除标准：术前接受化疗和放疗或患有其他相关肿瘤的患者。肿瘤分期按照美国癌症联合委员会/国际抗癌联盟（2016）共同发布的肿瘤TNM分期第8版。组织学分级由2名病理科医师分别根据WHO分级标准确定。CEA水平采用放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA）测定，使用CEA-RIA试剂盒。本研究经温州医科大学附属第二医院伦理委员会批准（LCKY2019-223）。
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学分析：采用免疫组织化学检测CRC及癌旁组织中SECTM1的表达。将石蜡包埋切片在二甲苯中脱蜡，并在乙醇溶液中水化。切片在室温下用过氧化氢浸泡，清水冲洗后，浸入枸橼酸盐缓冲液中，然后在正常山羊血清中浸泡30 min。最后，将切片与抗SECTM1抗体（稀释1∶20 000）在湿培养箱培养过夜，然后加入山羊抗兔IgG在室温下培养30 min。使用3，5-DAB进行检测，并用苏木精对切片进行复染。2名病理科医师独立分析结果。如果结果不一致，则使用双头显微镜重新评估，以获得最终结果。SECTM1蛋白表达的组织化学评估包括染色强度（无染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕色为3分）和阳性细胞百分比（＜5%阳性CRC细胞为0分，5%～25%为1分，＞25%～50%为2分，＞50%～75%为3分，＞75%为4分）。将染色强度和百分比评分相加，0～3分为阴性表达，4～7分为阳性表达。
1.2.2 细胞培养和细胞系构建：选取6种人CRC细胞系（HCT116、RKO、Caco-2、HT-29、DLD-1和HCT-8）和正常人结肠上皮细胞系（NCM460），均接种于RPMI1640和FBS的培养基中培养。用AgeI/NheI酶切SECTM1序列（NM_003004），并克隆到GV367慢病毒载体中感染HCT116 CRC细胞系。将HCT116细胞系分2组，第1组为SECTM1过表达（overexpression,OE）组（OE组），第2组未处理为正常对照组（NC组）。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000将siRNA-SECTM1（CACCAGAGAAATAACAGACAA）和siRNANC（TTCTCCGAACGTGTCACGT）转染DLD-1细胞系。将DLD-1细胞系分3组，其中敲除组（knocked down，KD）分为2组分别为KD1组和KD2组，1组为NC组。荧光显微镜（Olympus-BX53）用于确认是否转染了靶细胞，确保感染率约80%。
1.2.3 qRT-PCR：根据试剂盒的说明，使用TRIzol从CRC细胞系中提取总RNA，并反转录获得cDNA。GAPDH作为内参。SECTM1目的基因序列引物为5’-GTC ACTGCTGTCTTCATCCTCT-3’和5’-GACCTTCATCTGGGGTTC TAG-3’，扩增片段大小为117 bp。采用SYBR Master Mixture和qRT-PCR仪进行实时定量PCR。相对转录水平通过2-ΔΔCT法进行数据分析。
1.2.4 Western blot实验：从细胞中分离蛋白质，并进行蛋白质浓度测定。蛋白质样品加到凝胶上分离并转移到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉封闭30 min。一抗4 ℃孵育过夜。洗去多余一抗后，将PVDF膜浸泡于HRP标记的二抗（1∶5 000稀释）中，37 ℃摇床孵育2 h。洗去二抗后显色曝光。
1.2.5 细胞增殖实验：细胞培养1～5 d，每孔加入10 μL CCK-8试剂继续培养2～4 h。用酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）读板仪测定450 nm处的吸光度，以反映细胞增殖情况。
1.2.6 细胞凋亡实验：用胰酶消化并收集细胞。在黑暗中加入10 μL膜联蛋白V-APC。在测试前5 min加入碘化丙啶（propidium iodide, PI）。采用流式细胞仪分析细胞凋亡。膜联蛋白V-APC阳性细胞被认为是凋亡细胞。
1.2.7 细胞周期实验：用胰酶消化并收集细胞。处理后，将细胞固定在4 ℃预冷的乙醇中至少1 h。加入一定体积的细胞染色液和RNA酶。采用流式细胞仪检测PI浓度，反映各期细胞的DNA分布情况，并计算各期细胞的百分比。
1.2.8 侵袭小室实验：在内室和外室之间覆盖基底膜。将面向内室的基底膜置于外室，向外室添加趋化剂。在趋化剂的诱导下，细胞开始穿透基底膜。培养48 h后，用棉签去除小室的非侵入性细胞，在膜的下表面滴入2～3滴Giemsa染色液染色转移细胞并固定3～5 min。将细胞浸泡、洗涤多次，风干，显微镜成像，进行数据分析。
1.3 统计学处理方法 采用SPSS22.0进行数据分析。计量资料用±s表示，2组间比较采用独立样本t检验。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。计数资料用频数表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 CRC组织中SECTM1的表达及其与临床病理特征的关系 免疫组织化学分析结果显示，370例CRC组织样本中，有277例SECTM1高表达（277/370，74.86%），高于配对癌旁组织（93/370，25.14%），见图1。此外，SECTM1的表达与CRC分化程度和淋巴结转移相关（P＜0.05），而与年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小、UICC分期和CEA水平无关（P＞0.05），见表1。
图1 免疫组织化学染色法检测CRC组织和配对癌旁组织中SECTM1的表达（×400）
表1 CRC患者SECTM1表达与临床病理特征的关系（n=370，例）
2.2 慢病毒介导的CRC细胞中SECTM1 mRNA过表达或下调 采用qRT-PCR法检测6种CRC细胞系（HCT116、HT29、Caco-2、RKO、DLD-1和HCT-8）和正常人结肠上皮细胞系（NCW460）中SECTM1 mRNA的相对表达情况。qRT-PCR结果显示，HCT116细胞系中SECTM1低表达，DLD-1细胞系中SECTM1高表达，我们选择以上2种细胞系进行下一步实验。设计siRNASECTM1和过表达SECTM1的慢病毒，然后转染到CRC细胞中。根据荧光显微镜发现，慢病毒载体成功转染HCT116细胞系（见图2a）和DLD-1细胞系（见图2b）。在慢病毒介导转染后，相对于NC组，OE组HCT116细胞中SECTM1表达显著上调（P＜0.05），见图2c。同样，相对于NC组，KD1组和KD2组DLD-1细胞SECTM1的表达下调（P＜0.05），见图2d。
图2 慢病毒介导的SECTM1过表达或敲除
2.3 慢病毒介导的CRC细胞中SECTM1蛋白表达
Western blot检测结果表明，在慢病毒介导转染后，与NC组比，OE组HCT116细胞系中SECTM1蛋白表达上调（P＜0.01），KD组DLD-1细胞系中SECTM1的蛋白表达显著下调（P＜0.01），见图3。
图3 SECTM1蛋白在HCT116细胞系和DLD1细胞系中的表达
2.4 SECTM1对CRC细胞增殖的影响 转染5 d后，CCK-8检测结果表明，与NC组相比，OE组HCT116细胞增殖能力增强（P＜0.05），表明该基因过表达促进细胞增殖；
与NC组相比，KD组DLD-1细胞的增殖能力显著降低（P＜0.05），说明敲除该基因可以抑制细胞增殖。见图4。
图4 SECTM1对CRC细胞增殖的影响
2.5 SECTM1对CRC细胞凋亡的影响 流式细胞术分析结果显示，与NC组比，OE组HCT116细胞的凋亡率降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；
KD组DLD-1细胞凋亡率升高（P＜0.01）。这些结果表明敲除SECTM1可促进细胞凋亡。见图5。
图5 SECTM1对CRC细胞凋亡的影响
2.6 SECTM1对CRC细胞周期的影响 为了验证靶基因对细胞周期的影响，在转染后第6天使用流式细胞术检测PI荧光强度，该荧光强度直接反映DNA在细胞不同阶段的分布情况。结果表明，与NC组比，OE组HCT116细胞G1期细胞的比例显著下降，S期细胞比例和G2/M期的比例增加（P＜0.05），见图6a、图6b，这表明细胞周期进程加快。与NC组比，KD组DLD-1细胞G1期细胞比例显著增加（P＜0.05），而S期和G2/M期的细胞差异无统计学意义（P＞0.05），见图6c、图6d，这表明，SECTM1基因敲除导致细胞周期停滞在G1期。
图6 SECTM1对CRC细胞周期的影响
2.7 SECTM1对CRC细胞侵袭的影响 转染48 h后，侵袭小室实验结果表明，相对于NC组，OE组HCT116细胞每个区域的侵袭细胞数增加（P＜0.01），这表明，SECTM1的过度表达增强了细胞入侵。相对于NC组，KD组DLD-1细胞每个区域的侵袭细胞数减少（P＜0.01），表明SECTM1下调抑制细胞侵袭。见图7。
图7 SECTM1对CRC细胞侵袭的影响（×200）
SECTM1以一种可溶性跨膜蛋白形式存在于高尔基体中，与受体CD7结合诱导CD4+和CD8+T细胞产生IFN，并激活抗原提呈细胞（antigen-presenting cell, APCs），在免疫调节中发挥重要作用[12]。在本研究中，我们发现SECTM1在CRC中高表达，这与乳腺癌[10]和黑色素瘤[13]中观察到的结果相似，提示SECTM1可能参与癌症的发生。本研究进一步分析了SECTM1在CRC组织中的表达与临床病理参数之间的关系，发现SECTM1表达与淋巴结转移和CRC分化程度有关。KAMATA等[14]认为SECTM1是一种上皮产物；
然而，他们没有提到成熟的腺上皮细胞中是否有一种物质可以促进SECTM1的高表达。许多研究称，SECTM1能促进免疫细胞的增殖，如T细胞与CD28的结合[11-12]，因此SECTM1与细胞免疫有关，是编码与免疫信号通路相关的基因[15]。然而，还需要进一步的研究来验证。
我们进一步分析SECTM1对CRC细胞的影响后发现，与NC组相比，上调SECTM1后CRC细胞的生存能力和侵袭能力明显增强，细胞周期加快，凋亡减少；
下调SECTM1的表达则相反。WANG等[16]表明在黑色素瘤细胞系WM3899中SECTM1的过表达显著增加了细胞侵袭，并促进了肿瘤生长和转移。在黑色素瘤细胞系WM9中降低SECTM1的表达，可以抑制肿瘤的生长和转移，这与我们的结果一致。然而，涉及SECTM1的致癌机制可能有不同的声音：它部分依赖于CD7介导通路的激活来吸引单核细胞改变微环境[13]；
另一部分依赖于调节因子的表达，如SECTM1上调整合素β3的表达，从而促进其自身在黑素瘤中的表达[15]。SECTM1在癌症患者中似乎没有体细胞突变[17]，但在癌症[18]和其他疾病如肠易激综合征[19]和黑素瘤[20]中经常过表达，强调了对SECTM1基因表达的操纵也可能在癌细胞和肠黏膜上皮屏障细胞的免疫耐受中发挥作用。或者是通过与CD4+T、CD8+T、抗原呈递细胞等免疫相关细胞的相互作用，SECTM1可以削弱机体的免疫防御，促进肿瘤细胞的侵袭和迁移，引起淋巴转移。因此，SECTM1的表达可能是先天免疫反应和癌细胞免疫耐受的关键因素[21]。
本研究有一些局限性，需要在动物实验中进一步证实。本研究也没有探讨SECTM1在CRC中的致癌机制。GU等[22]利用肿瘤基因组中的基因表达数据筛选出免疫相关预后基因SECTM1。下一步的研究方向是研究SECTM1对CRC微环境的免疫相关作用，明确免疫相关通路、上下游因素。进一步研究SECTM1靶向药物通过共抑制或共刺激信号等一系列途径调控免疫细胞活性，从而杀死肿瘤细胞的治疗方法。
综上所述，本研究结果表明SECTM1是一个潜在的治疗靶点，为未来CRC的靶向治疗提供了重要的线索。
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