周强强 韦晓玲 谢 玉 刘 辉
（上海市口腔医院，上海市颅颌面发育与疾病重点实验室，上海 200001）
众所周知，根管治疗的关键在于根管消毒，常规清理根管的方法包括机械预备和化学消毒，由于根管的解剖变异，常规的消毒方法难以彻底清理复杂根管系统内的根管峡区、根尖分歧，侧支根管等区域，残留的细菌是导致根管治疗失败的主要原因[1]。大量研究都从治疗失败的根管中分离出粪肠球菌[2]。
有研究表明：高浓度NaClO 与细菌发生接触后，对其有明确的杀灭作用，但NaClO 对根管系统中无法接触到的细菌难以清除[3]。目前临床上急需一种高效、彻底、针对复杂根管的消毒方法。随着激光在口腔治疗中的应用发展，不同种类的激光被开发并应用于根管消毒。这些激光在以往的研究中都被证明对根管消毒有一定作用[4]，其中半导体激光因具有波长短，穿透能力强，不易被水、牙釉质、血液等口腔内物质吸收的特点，相较于超声活化荡洗和其他类型激光在消毒效果上有优势[5]。但目前大量研究局限于低功率半导体激光结合光敏剂的杀菌效果[6]，且多数是建立简单根管感染模型来评估效果，由于根管生物膜是一种非常复杂的、有组织的实体，单根管年轻生物膜的研究可能过度简化了这种生态现象，无法真实反映临床中的杀菌效果，容易得到假阳性结果。
本研究利用锥形束 CT 筛选含有峡区的复杂根管，期望通过建立复杂根管感染模型，多维度地探讨半导体激光在体外对复杂根管系统内粪肠球菌的杀灭效果，为其临床应用提供依据。
1.1 主要材料和仪器
锥 形 束 CT（CBCT Planmeca Pro-Max®3Dmax，芬兰）；
粪肠球菌标准菌株冻干粉（ATCC29212，美国）；
机用镍钛锉（登士柏x·smart ™ plus，美国）；
半导体激光治疗仪 （Doctor Smile® D5，意大利） ；
扫描电子显微镜电镜（SEM日立Hitachi 3400N，日本）、激光共聚焦显微镜（CLSM 尼康A1HD25，日本）；
厌氧培养箱（DY-2，中 国）；
CystalspecTM比 浊 仪（Becton Dickinson，美国）。LIVE/DEADTMBacLightTM细菌活力检测试剂盒（InvitrogenTML-7012，美国）
1.2 建立根管感染模型
1.2.1离体牙收集与处理 收集 2020 年6 月至12月期间于上海市口腔医院因牙周病或正畸需要而拔除的人新鲜前磨牙、磨牙若干颗。患者均知情同意。离体牙的纳入标准：
牙根完整、根尖孔发育完全、未行根管治疗、 无裂纹。5.25%NaClO 浸泡消毒后，置于自制的托盘上，拍摄CBCT（见图1），筛选含有峡部的牙齿42 颗（其中前磨牙21颗、磨牙21 颗）。用高速手机从釉牙骨质界截冠，剩余牙根用机用镍钛锉（Protaper Universal）配合17%EDTA 常规操作预备根管，按照ISO 标准预备至06 锥度，30#，高温高压消毒后，使用复合树脂封闭根尖孔。
1.2.2感染根管模型的建立 将粪肠球菌标准株冻干粉（ATCC29212，美国）常规复苏后划线接种于脑-心浸液 （ BHI） 琼脂培养皿， 置于37℃、5% CO2厌氧培养箱中培养24 h， 分离单菌落并接种于含有脑-心浸液肉汤培养基的无菌试管中，继续37℃厌氧培养24 h。使用麦氏比浊仪将菌液浓度调整到1×108CFU·mL-1，再将制备好的牙根浸没于含有1×108CFU·mL-1的菌悬液中，连续厌氧培养21 d，每3 d 换液一次。培养结束后随机抽取 2 个牙齿样本， 用1 mL 无菌生理盐水（NS）溶液冲洗根管，使用无菌纸尖收集冲洗液进行接种培养24 h。将牙根纵向劈开进行SEM 观察；
检测感染根管模型是否建立成功。
1.3 实验分组和根管消毒
将剩余40 个样本随机分为 4 组（n= 10），本实验中各组的消毒处理方法见表1。
表1 各组根管消毒处理方法
各组NS 与NaClO 的冲洗液用量为1 mL，冲洗60 s，结束后无菌纸尖吸干根管。半导体激光模式设置为Endo-02 脉冲输出、功率为2.5 W、光纤直径200 μm，以2 mm/s 的速度从根尖螺旋移动10 s（激光辐射方法按照厂商提供的说明书进行）。
1.4 根管消毒效果研究
1.4.1 菌落计数分析 各组处理后用1 mL 生理盐水冲洗根管，每组各取06 锥度，25#无菌纸尖置于根管内30 s，收集冲洗液培养，然后将无菌纸尖置于2.5 mL 的BHI 培养液中培养24 h 后按照1 000 倍比例稀释，接种于BHI 琼脂培养皿继续培养24 h，计算各组形成的菌落数。杀菌率=（处理前菌落数-处理后菌落数）/处理前菌落数
×100%。
1.4.2 SEM 观察根管峡区及内壁 从采菌后的各组中随机抽取1 个样本，采用高速裂钻沿牙根长轴方向制备出两条较平行的深沟，不贯通到根管内壁，劈开牙根，暴露根管壁及峡区。置于2.5% 戊二醛中4℃冰箱静置固定24 h 后，依次用50%、70%、90%、100% 乙醇梯度脱水，每个梯度20 min，常温下自然干燥，随后粘胶、喷金，应用扫描电镜观察牙冠剖面。
1.4.3 细菌活死染色及CLSM 观察 使用LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability 试剂盒对剩余粪肠球菌生物膜样本进行染色。将各组牙根剖面向上放置于每孔含1 mL 生理盐水的12 孔板中，使剖面完全浸于染液中，随后每孔加入3 μL（SYTO 9/PI）1 ∶1 混匀的染色液，常温避光孵育15 min，PBS 缓冲液冲洗3 次，立即使用CLSM 进行观察。每个样本随机选取5 个视野于20 倍镜下进行观察，调整步长为10 μm，扫描层厚200 μm。
1.5 统计学分析
使用SPSS 17.0 统计软件对数据进行单因素方差分析，两两比较用 LSD-t检验，检验水准P= 0.05。
2.1 粪肠球菌感染根管模型的建立
培养21 d 后，随机抽取样本的菌落培养24 h的结果显示：根管内壁大量粪肠球菌（图2A）。SEM 观察：粪肠球菌生物膜形成，表面玷污层存在（图2B）；
根管内壁密集了大量的粪肠球菌，并阻塞了牙本质小管开口。纵向劈开的根管内壁可见细菌侵入牙本质小管深层（图2C、D）。
2.2 各组菌落计数结果
处理后菌落计数结果如表2 显示：A、B、C组处理后菌落计数均小于D 组（P＜0.05），其中B组杀菌效果最好，杀菌率高达98.4%；
A、D 组杀菌率低于B、C 组（P＜0.05）；
单纯使用激光组不如传统冲洗液组的杀菌效果好（P＜0.05），见图3。
表2 各组菌落计数及杀菌率（n=10， ±s）
表2 各组菌落计数及杀菌率（n=10， ±s）
注：
*表示同组内处理前后比较P＜0.05；
abcd 表示不同组间两两比较P＜0.05。
组别菌落计数（CFU·mL-1） 杀菌率（%）处理前 处理后A 80.4±5.32 53.2±8.67* 33.89±9.35bcd B 85.2±6.06 1.40±1.34* 98.40±1.59acd C 85.2±4.32 14.6±4.93* 82.84±5.58abd D 85.6±3.51 82.4±2.30* 3.68±2.30abc
2.3 SEM 观察根管内壁细菌清除作用
观察各组处理后根管内壁粪肠球菌定植情况，SEM 结果如图4 所示：0.9%NaCl 冲洗组（图4D组）表面玷污层存在，表面大量粪肠球菌定植在，阻塞牙本质小管开口；
激光处理（图4A 组）未能完全去除表面玷污层，仍有部分细菌残留；
5.25%NaClO 冲洗液处理组（图4C 组）玷污层已被清除，根管壁平整无细菌，但牙本质小管内仍有少量细菌残留；
半导体激光联合5.25% NaClO（图4B 组）表面细菌和玷污层被完全清除，根管壁光滑平整，牙本质小管开放，此外纵向切开的牙本质小管内无细菌附着。
2.4 CLSM 观察细菌染色结果
染色后活菌发绿色荧光，死菌因菌膜受损被红色荧光染色，三维重建 CLSM 图像后进行整合（见图5）。经Image-Pro Plus 6.0 软件计算死细菌比例并进行统计分析，结果显示：0.9%NaCl 组（图5D1）感染的根管系统显示均匀的绿色荧光，红色荧光几乎未见，提示根管壁聚集大量粪肠球菌，细菌渗透深度达200 μm 以上；
进行不同处理后绿色荧光减弱，红色荧光增强，提示各处理组与空白组相比，死菌比例均有明显提高（P＜0.05，见图6）；
其中Diode 激光+5.25%NaClO（图5B 组）绿色荧光信号最弱，红色荧光强度信号最强（图5B2），在各组中杀菌效果最好（P＜0.05）。
现代根管治疗的核心内容是彻底清除根管内的感染和严密的三维充填，而研究显示目前所有的方法都不能完全清理位于RCI 的细菌生物膜。Estrela 针对1 400 颗恒牙的研究表明：RCI 在下颌第一磨牙的发生率最高，为87.9%，下颌第二磨牙、上颌第一磨牙的发生率分别为66.3%、60.8%[7]。本研究通过CBCT 筛选含峡区的离体牙，采用了连续培养3 周、简单、标准化和重现性好的成熟单菌种生物膜系统，首次建立了复杂根管感染模型，多维度比较各分组间的杀菌效果，结果显示：B 组激光联合NaClO 冲洗液杀菌效果最好，杀菌率高达98.4%，说明激光联合NaClO 冲洗液在复杂根管的消毒中可以取得较好地效果，与其他学者研究结果一致。单纯次氯酸钠和单纯激光处理的杀菌率约为83%和34%，说明半导体激光可作为传统消毒方法的补充，联合使用可取得理想的杀菌效果，但尚不能取而代之。
半导体激光杀菌原理是光热生物作用，通过瞬时局部高温杀菌，但是有报道指出温度升高可能导致牙本质碳化，牙根变性和根尖周围坏死等[8]。激光引起升温的影响因素有激光类型，功率，频率，波长、操作工作时间和方法等，且不同的解剖形态，牙根厚度，对温度变化也有影响。有学者利用二极管激光辅助牙髓治疗后检测到牙根表面的温度变化都控制在阈值以下，说明高功率二极管激光是安全的[9、10]。本研究中通过脉冲辐射、连续移动、间歇激光照射的方法，按照厂家推荐的使用方法，以减少周围组织热损伤。为避免热损伤的出现，临床使用中应该严格按照标准操作，控制激光照射时间，保证诊疗安全。
近年来，随着各种辅助冲洗技术的临床应用，超声活化荡洗（PUI）因效果明确、操作简单受到了较多的关注，超声辅助冲洗的原理在于形成空穴效应和声流作用，前提都是冲洗液存在，Pacheco 的研究结果表明正压冲洗、XP-endo Finisher、PUI 三种技术处理磨牙根管峡区，冲洗液分布面积没有差异，可能由于冲洗液一旦在根管内形成气锁作用，超声就无法发挥作用[11]，而且超声的高频振动可能会把冲洗液推出根尖孔。大量研究都表明不管是超声还是激光联合传统冲洗液，可以达到较好的根管消毒的效果，但两者作为辅助根管消毒的方法并不对立，两者之间的比较尚无定论[12、13]。最后，本实验与以往大多实验的建立简单根管感染模型相比有一定进步，但无法完全复制真实的根管系统，其结果有待高质量的临床研究加以验证。
综上所述，高功率半导体激光联合传统次氯酸钠冲洗液比两者单独使用具有更高的杀菌率，能够有效清除复杂根管（含峡区）内的细菌微生物，但激光尚不能取代传统冲洗液在根管消毒中的作用，可作为传统消毒方法的补充在临床进行推广应用。
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