高江涛，梁馨文，张凯旋，刘建伟，邵明亮
西安诺众康健生物科技有限责任公司（西安 710000）
随着社会大众健康意识的觉醒，肠道内定殖的以1013～1014计的肠道菌群获得全球学术界和广大消费者极大的关注。学术界从认识普及肠道是人最大的免疫器官，到不断发表的“脑-肠轴”、“肝-肠轴”、“肾-肠轴”等模型研究，以及不断报道的肠道菌群与寿命、肠道菌群与肥胖关系、肠道菌群与糖尿病关系、肠道菌群与老年痴呆等病理的发现，越来越深入的研究发现肠道菌群几乎与身体健康密不可分，调节肠道菌群来改善身体健康已成为研发工作者和消费者关注的重中之重[1]。市场上大众消费者已形成食用益生菌酸奶、益生菌功能食品调节肠道，改善身体健康的习惯，益生菌市场俨然成为一片巨大的蓝海。
目前补充益生菌调理肠道菌群的手段主要有两种，外部活菌补菌（即益生菌补菌）和内部自身肠道菌增殖（即益生元补菌）。活菌补菌目前最为盛行，但一直存在着诸多不足饱受诟病，诸如定殖率低、活菌存活率、产品货架期短等问题。而益生元作为肠道菌群的食物和促进物质，具有稳定性好、货架期长的天然优势，能很好地解决以上缺点，因此通过益生元或合生元（益生菌+益生元）补菌调理肠道菌群成为肠道健康重要的方向[2-4]。
益生元（prebiotics）是由GR. Gibson等[5]提出，是指一些不被宿主消化吸收却能有选择地促进其体内肠道有益菌的代谢和增殖，从而改善宿主健康的有机物质。益生元具有以下特点：（1）不被宿主胃肠道消化或吸收；
（2）只能被一种或有限几种肠道菌利用；
（3）能改善肠道菌群组成，增进宿主健康；
（4）诱导肠腔内系统性免疫，改善宿主体质。目前被广泛熟知的益生元有低聚果糖、菊粉、低聚甘露糖、水苏糖、低聚半乳糖、低聚木糖等。Markus[6]研究发现低聚果糖作为唯一的碳源时，对唾液乳杆菌W57的增殖效果较差，但却能够显著促进副干酪乳杆菌W20的生长增殖；
夏晓风[7]研究了六种常用低聚糖（低聚异麦芽糖，低聚果糖，低聚半乳糖，低聚木糖，乳酮糖和低聚乳糖）对乳酸菌（嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）和大肠杆菌（Escherichia coli）生长的影响，结果显示乳酮糖替代量为25%时，保加利亚乳杆菌生长量最大；
可见，不同肠道菌对特定的益生元的利用度存在较大差异[8-11]。
针对不同肠道菌对特定的益生元的利用度差异较大的问题，本研究选择肠道代表性有益菌鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、加氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜黏蛋白阿克曼菌以及肠道有害菌阴沟肠杆菌共七种肠道菌，以及低聚半乳糖、低聚木糖、低聚甘露糖、水苏糖、低聚果糖五种益生元作为研究对象，通过体外试验，分析各益生元对肠道代表性菌增殖情况的影响，以期确定不同益生元对肠道菌群的影响规律，为益生元产品配伍及应用开发奠定理论基础。
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
低聚甘露糖（85%，西安诺众康健生物科技有限责任公司）；
菊粉（90%，重庆骄王天然产物股份有限公司）；
低聚木糖（95%，山东龙力生物科技股份有限公司）；
水苏糖（80%，西安天美生物科技股份有限公司）；
低聚半乳糖（90%，山东百龙创园生物科技有限公司）。D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、D-木糖（北京索莱宝生物科技有限公司）。
肠道有益菌：鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosusATCC7469）、多形拟杆菌（BacteroidesthetaiotaomicronATCC29148）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilusATCC4356）、植物乳杆菌[Lactobacillus plantarum（Orla-Jensen）HollandATCC8014]、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillusreuteri、CICC 10855）、嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphilaCICC24917）、加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseriCICC24878）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricusCICC20247）。
肠道有害菌：阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacaeCICC10450）。
上述菌种购置于中国微生物菌种保藏中心（ATCC）和中国食品发酵工业研究院（CICC）。
1.1.2 试剂
酪蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、牛肉浸粉、脱水小牛脑浸粉、脱水牛心浸粉、蛋白胨、葡萄糖、琼脂、氯化钠、乙酸钠、柠檬酸二铵、黏蛋白、Tween 80、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCO3、KH2PO4。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-2FD超净工作台（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；
LDZF-50L高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；
厌氧培养箱（上海龙跃仪器设备有限公司，LAI-3）；
BDW-86L390-Y-80 ℃超低温冰箱（上海一恒科学仪器有限公司）；
Alpha1502紫外分光光度仪（上海谱元仪器有限公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 培养基
MRS基础培养基
酪蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二铵2.0 g，Tween 80 1.0 g，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·H2O 0.05 g，CaCO320.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1.0 L，pH 6.8。
BHI+2 g/L黏蛋白：脱水小牛脑浸粉12.5 g、脱水牛心浸粉5 g、蛋白胨10.0 g、葡萄糖2.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂20.0 g、2 g黏蛋白、蒸馏水1 000 mL、pH 6.8～ 7.4（Biobw菌种推荐培养基）。
营养琼脂培养基（NA）：牛肉浸粉10.0 g，蛋白胨10.0 g，葡萄糖10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15.0～20.0 g，蒸馏水1.0 L，pH 7.0。
缺碳培养基：将菌株可利用的培养基除去碳源，即为缺碳培养。
益生元培养基：缺碳培养基中加入2%重量比的益生元，则制备成相应的益生元培养基。
1.3.2 培养方法
菌种活化：用无菌吸管吸取0.3～0.5 mL的液体培养基或者无菌水，滴入冻干管中，轻轻振荡至其溶解。吸取全部菌悬液，接种在固体培养基上；
操作完毕，平皿倒置，指定培养条件下培养。
菌种液：挑取平皿上的单菌落接种至装有菌落指定液体培养基的试管中，试管密封，指定培养条件下培养，得一级菌悬液。
表1 培养条件
1.3.3 影响试验
按3%接种量，将培养好的一级菌悬液分别接种至基础培养基、缺碳培养基和益生元培养基中，培养基装液量为试管体积的90%，密封，于37 ℃厌氧袋内培养箱恒温静置培养[12]。
1.3.4 生长测定
培养48 h，菌液用分光光度计在波长600 nm处测定吸光度（A）。
1.3.5 数据统计
研究的所有试验处理均设计了3个生物学重复并进行平行测定。数据使用SPSS 22.0进行单因素方差分析和Duncan法多重比较，以P＜0.05表示差异显著。
2.1 益生元及单糖对肠道微生物的影响试验
2.1.1 益生元对肠道有益菌的增殖试验
益生元对益生菌的促增殖能力通常以发酵液的A600作为指标以评价菌体数量。试验确定菊粉、低聚木糖、水苏糖、低聚半乳糖以及低聚甘露糖对5种乳杆菌的增殖规律，结果如图1所示：（1）低聚甘露糖对鼠李糖乳杆菌、加氏乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌等4株乳杆菌有明显的增殖效果，厌氧培养24 h，菌液吸光度均大于1.5，但对罗伊氏乳杆菌两组菌株增殖效果较差。（2）水苏糖对除加氏乳杆菌以外的其他4株乳杆菌有较好的增殖效果，厌氧培养24 h，菌液吸光度均大于1.0，对罗伊氏乳杆菌增殖效果最佳。（3）低聚半乳糖对罗伊氏乳杆菌和保加利亚乳杆菌2株乳杆菌有较好的增殖效果，厌氧培养24 h，菌液吸光度均大于1.5。（4）菊粉和低聚木糖对乳杆菌的增殖效果较差，厌氧培养有益菌24 h，A600多数都小于1.0。
图1 不同益生元对乳杆菌的增殖效果
Akkermansia muciniphila是一种从粪便中分离到的严格厌氧肠道菌，在肠道中的丰度通常占1%～3%，可以利用肠道黏蛋白作为唯一碳源和氮源进行生长，主要代谢产物为丙酸。Akkermansia muciniphila在肠道中的定殖与宿主的健康息息相关，它可以改善肥胖、糖尿病患者的炎症反应以及胰岛素抵抗和葡萄糖耐受等不良症状，还可以调节机体的免疫应答，维持体内代谢平衡，5种益生元中水苏糖和低聚甘露糖对Akkermansia muciniphila的增殖效果优于其他益生元，但均低于阳性对照葡萄糖（图2）。
图2 不同益生元对Akkermansia muciniphila的增殖效果
综上可知，5种益生元中低聚甘露糖、水苏糖和低聚半乳糖对乳杆菌等肠道有益菌表现出较好的增殖效果，菊粉和低聚木糖的增殖效果较差。
2.1.2 益生元对肠道有害菌的影响试验
阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）是肠杆菌目肠杆菌科肠杆菌属的一种细菌，存在于人和动物的粪便水、泥土、植物中，是肠道致病菌种之一。5种益生元对其体外影响试验结果显示（图3）：阴沟肠杆菌能够更好地利用低聚木糖、菊粉，对低聚甘露糖、水苏糖和低聚半乳糖利用率较低。
图3 不同益生元对阴沟肠杆菌的影响
2.1.3 单糖对肠道微生物的影响试验
肠道微生物对不同益生元的利用存在较大的差异，为了明确其原因，试验进一步测定了D-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、D-木糖、D-甘露糖和D-阿拉伯糖对肠道微生物的影响规律，结果如图4所示：（1）D-甘露糖对植物乳杆菌、加氏乳杆菌和保加利亚乳杆菌有较好的增殖效果；
（2）D-果糖对除加氏乳杆菌和保加利亚乳杆菌以外其他菌种有较好的增殖效果；
（3）D-半乳糖对加氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和保加利亚乳杆菌等3株乳杆菌增殖效果较好；
（4）D-木糖和D-阿拉伯糖对乳杆菌的增殖效果较差。
图4 不同单糖对乳杆菌的增殖效果
D-果糖和D-甘露糖对Akkermansia muciniphila的增殖效果优于其他单糖，但均低于阳性对照葡萄糖（图5）。
图5 不同单糖对Akkermansia muciniphila的增殖效果
阴沟肠杆菌能够更好地利用D-木糖、D-半乳糖，而对D-甘露糖利用率较低。
图6 不同单糖对阴沟肠杆菌的影响
综合上述低聚糖益生元和单糖益生元的试验结果，将对几种肠道益生元增殖效果较好的益生元和单糖汇总于表2。由表中结果可以发现，低聚半乳糖、低聚甘露糖、水苏糖对多数肠道有益菌的增殖效果优于其他益生元，而对有害菌阴沟肠杆菌的促生长效果不明显。D-半乳糖、D-甘露糖和D-果糖对肠道有益菌增殖效果优于其他单糖，推测低聚半乳糖、低聚甘露糖、水苏糖对肠道有益菌增殖效果优于其他益生元，可能与其对应单糖增殖效果好且有益菌能够产生高活性α-半乳糖苷酶和β-甘露聚糖酶相关。
表2 不同益生元和单糖增殖效果统计
2.2 复合益生元对肠道微生物的影响
根据上述试验结果，将对肠道有益菌有较好增殖效果的3种益生元低聚甘露糖、低聚半乳糖和水苏糖进行两两复配，旨在筛选出对肠道有益菌有增殖效果，而对有害菌无明显促生长作用的益生元组合。结果如表3所示。
表3 复合益生元对肠道菌群的影响试验
低聚甘露糖和水苏糖比例为3∶1（MOS∶Sta= 3∶1）时对5种乳杆菌和Akkermansia muciniphila有较好的增殖效果，且对阴沟肠杆菌无明显促生长作用，可作为最佳的复合益生元组合。
通过试验研究了不同种类益生元（菊粉、低聚木糖、水苏糖、低聚半乳糖和低聚甘露糖）对肠道有益菌鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、加氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、Akkermansia muciniphila以及肠道有害菌阴沟肠杆菌的影响规律，得到如下结论：
1) 低聚甘露糖、低聚半乳糖、水苏糖对多数有益菌的增殖效果优于低聚木糖和菊粉，而对有害菌阴沟肠杆菌的促生长效果不明显。通过D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖、D-阿拉伯糖和D-果糖各类单糖对肠道菌的体外试验，明确D-半乳糖、D-甘露糖和D-果糖对肠道有益菌增殖效果较优，推测益生元对某种肠道菌的增殖效果可能与其对应单糖的增殖效果具有一定的相关性。
2) 低聚甘露糖和水苏糖比例为3∶1（MOS∶Sta= 3∶1）时对肠道有益菌有较好的增殖效果，且对有害菌无明显促生长作用，可作为最佳的复合益生元组合。
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