杨柳青，杨美虹，刘 波，张 倩，李新霞，
(1.郑州大学附属洛阳市中心医院病理科，河南洛阳 471099；
2.新疆医科大学附属肿瘤医院病理科，新疆 乌鲁木齐 830011)
弥漫大B 细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是一种发病率较高的非霍奇金淋巴瘤，约占世界上B 细胞淋巴瘤的37%[1]。DLBCL 具有多样的分子和遗传背景，导致疾病的发展具有异质性[2]，由于DLBCL 的高侵袭活性，一部分患者预后较差，因此仍需要更敏感的诊断标志物。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内源性小RNA 分子，约含20～22 个核苷酸，在基因调控中起重要作用，它们与特定的信使RNA(mRNA)配对，导致mRNA降解进而调节蛋白质转录后的翻译[3]。早期循环DNA 的检测数据表明，因血液中的miRNA 易于获取，“血液活检”方法已成为诊断DLBCL 的可行方法之一[4]。研究表明，早期诊断和及时治疗可以降低患者死亡率[5]。然而，miRNA在DLBCL的诊断中的实际可行性还没有完全阐明。本项研究借助GEO 数据库筛选了DLBCL 中一些功能性miRNA，在miRTarBase预测其潜在靶基因，并通过DAVID数据库进行基因功能分析。此外，我们还利用Cytoscape 软件构建了蛋白质相互作用(proteinprotein interaction，PPI)网络和miRNA-核心基因(hub基因)调控网络，目的是筛选异常表达miRNA(differentially expressed microRNA，DE-miRNA)及其靶基因，并探讨其在DLBCL发生发展中的潜在价值。
1.1 miRNA微阵列
从美国国家生物技术信息中心(NCBI)综合数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下载GSE117063 数据集，该数据集的基因表达谱基于GPL25327 Exiqon Human miRCURY LNA Universal RT miRNA PCR Human Serum/Plasma focus panel(V3.0)平台，此平台的实验数据是由Steffen J团队提供，共有31例血浆样本，包含17例DLBCL患者和14例健康者样本。
1.2 DE-miRNA及靶基因筛选
利用GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)分析GSE117063 数据集中肿瘤和健康样本间的DEmiRNA。GEO2R 是利用R 包和limma 软件包分析GEO样本基因差异表达的在线网络工具，以P<0.05 和|log2(fold change)|>1.0为筛选标准，将DE-miRNA导入miRTarBase 数据库(http://miRTarBase.cuhk.edu.cn/)，预测其调控的潜在靶基因。
1.3 基因功能分析
DAVID(version 6.8，http://david-d.ncifcrf.gov/)用来对基因进行更深入的生物学功能分析，包括基因功能注释(GO)和京都基因百科全书和基因组(KEGG)通路富集分析。GO 分析包含以下3 个方面：细胞组分(cell component，CC)、分子功能(molecular function，MF)和生物过程(biological process，BP)。将靶基因导入DAVID 网站，P<0.05 为有统计学意义，取P值前5 位基因功能及前20条基因富集通路进行分析。
1.4 PPI与miRNA-基因网络构建
使用STRING 数据库(https://string-db.org/)分析上述靶基因表达的蛋白质相互作用网络，综合得分>0.4的交互作用结果被认为是显著的，将STRING 数据库得到的互作基因导入Cytoscape 软件，用CytoHubba 插件对PPI 网络连通性进行分析，构建miRNA-基因网络，获得核心基因(hub基因)，选取前10个hub基因进行进一步分析。
1.5 GEPIA基因验证
基因表达谱交互分析(GEPIA，http://gepia.cancerpku.cn/index.html)是基于TCGA 和GTEx 数据库中多种肿瘤和正常样本进行基因表达分析的一个网站，其所选样本亦有相关专业医师的指导[6]。本研究用此网站验证hub基因在DLBCL 组织和正常淋巴结组织中的表达，结果以箱视图呈现。
2.1 DE-miRNA及其靶基因
通过对GSE117063数据集的分析，与健康对照组相比，DLBCL 患者血浆中共检测出81 个DE-miRNA，其中17 个上调，64 个下调(P<0.05)，从上调和下调的miRNA 中筛选表达差异程度前3 位miRNA，见表1、表2。借助miRTarBase，预测出上调miRNA-326、miRNA-33a-5p、miRNA-199a-5p 的潜在靶基因471个，下调miRNA-205-5p、miRNA-375、miRNA-885-5p的靶基因705个。
表1 表达上调程度前10位的DE-miRNA
表2 表达下调程度前10位的DE-miRNA
2.2 GO分析
靶基因的GO分析如表3、表4所示，上调miRNA的靶基因主要参与蛋白质结合、转录因子结合、RNA聚合酶II核心启动子近端区序列特异性DNA结合、转录调控区DNA结合、转录因子活性和序列特异性DNA结合。其介导的分子富集在RNA聚合酶II启动子转录的正调控，转录和基因表达的正调控，DNA模板化等生物过程中。而下调miRNA 的靶基因参与RNA 聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控、转录正调控、DNA 模板化、病毒过程、凋亡过程、细胞增殖负调控等生物过程。此外，转录因子结合、同一蛋白结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合和转录辅激活子活性等分子功能。
表3 前3位上调DE-miRNA的靶基因的GO分析
表4 前3位下调DE-miRNA的靶基因的GO分析
2.3 KEGG通路富集分析
靶基因的KEGG 通路富集分析见图1，上调miRNA 的靶基因富集在癌症中的通路、HTLV-I 感染通路、癌症中的miRNA 和蛋白多糖以及Hippo 信号通路等。而下调miRNA的靶点富集在癌症中的通路、蛋白多糖、miRNA、PI3K-Akt信号途径和病毒致癌作用等通路。
图1 miRNA靶基因的KEGG分析
2.4 PPI和miRNA-hub基因网络分析
在STRING 中构建PPI 网络，根据蛋白质(基因)之间相互作用的节点度挑选前10个hub基因，其结果如表5所示。上调miRNA 的hub基因是丝氨酸/苏氨酸激酶1(serine/threonine kinase 1，AKT1)、v-myc 骨髓细胞瘤病病毒癌基因同源物(v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog，MYC)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、钙黏蛋白1(cadherin 1，CDH1)、NOTCH1、SRC 原癌基因-非受体酪氨酸激酶(SRC proto-oncogene，nonreceptor tyrosine kinase，SRC)、KRAS原癌基因-GTP酶(KRAS proto-oncogene，GTPase，KRAS)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)、雄激素受体(androgen receptor，AR)、酪氨酸激酶受体2(erb-b2 receptor tyrosine kinase 2，ERBB2)。下调miRNA的hub基因有肿瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)、MYC、磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)、SRC、丝裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)、VEGFA、连环蛋白β1(catenin β1，CTNNB1)、细胞分裂周期42(cell division cycle 42，CDC42)、热休克蛋白90α家族A 类成员1(heat shock protein 90α family class A member 1，HSP90AA1)、信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)。其中，6个hub基因被上调的miRNA-326 所调控，下调的miRNA-375 指向7 个hub基因，如图2。
表5 PPI网络的核心基因
图2 miRNA-hub基因调控网络
2.5 GEPIA基因验证
在上述hub 基因中，AKT1、CCND1、ERBB2、TP53、MYC、CTNNB1和HSP90AA1基因在DLBCL 中的表达均较正常组织升高，可视化的箱线图如图3 所示，其中AKT1、CCND1、ERBB2为miRNA-326 的靶基 因，而TP53、MYC、CTNNB1、HSP90AA1为miRNA-375的靶基因。
图3 DLBCL和正常样本中hub基因表达水平
DLBCL是一种高侵袭性的肿瘤，由于发病机制的复杂性，早期诊断仍有许多困难。有研究表明，miRNA由肿瘤细胞释放到循环血液中，以稳定的无细胞形式存在，并且血浆中miRNA谱在肿瘤和正常样本中是有差异的，因此可作为生物标志物辅助疾病诊断和治疗[7]。
GO 分 析显示，DLBCL 中DE-miRNA 的作用靶 点主要集中在基因表达调控、信号转导调控、细胞结合和细胞增殖调控以及细胞凋亡过程中。值得注意的是，上调或下调miRNA的靶基因都富集在细胞分裂和增殖的正调控，其可能在肿瘤细胞的增殖过程中起重要作用。
KEGG 分析显示靶基因主要富集在PI3K-Akt 信号通路，人T 细胞白血病病毒1 型(HTLV-1)感染以及细胞基质的蛋白多糖等通路。目前，病毒感染作为DLBCL的病因已成为后基因组时代的研究热点，本研究中，KEGG通路分析亦显示靶基因富集在HTLV-I病毒感染相关的通路。HTLV-I 主要感染CD4+T 淋巴细胞，Tax 是NF-κB 信号通路的有效激活剂，对HTLV-1感染的T细胞的存活和增殖至关重要[8]。蛋白多糖是由核心蛋白和多糖链组成的复杂大分子，分布在细胞外基质中，也存在于细胞表面和分泌颗粒中[9]。研究证明，蛋白多糖在免疫系统中起着重要作用，参与淋巴细胞增殖和迁移、炎症反应过程和B 细胞淋巴瘤的发 展[10]。本研究中，靶基因ERBB3、ERBB2、CTNNB1、CDC42、MYC、TP53、STAT3参与了蛋白多糖在肿瘤中的表达，其中ERBB2、CTNNB1、MYC、TP53在DLBCL中的表达异常。
通过构建miRNA-hub 基因调控网络，大多数hub基因可能受到miRNA-326 和miRNA-375 的调控。AKT1属于AKT 蛋白家族，AKT 蛋白激酶在细胞生长过程中起着关键作用，如参与糖代谢、基因转录、细胞增殖、迁移和凋亡[11]。本团队一直致力于DLBCL发生机制及通路的研究，借助NanoString-nCounter 技术检测PI3K主要催化亚基和调控亚基的扩增和缺失及其下游AKT 的亚基拷贝数，提示PI3K-Akt 通路可能在DLBCL 的发生和AKT 信号通路的激活中起重要作用[12]。与此对应，王晶等[13]的miRNA 图谱表明，与AKT 靶点相关的miRNA 在DLBCL 中也存在差异表达。HSP90AA1是HSP 家族的重要成员，是细胞在应激反应中合成的分子伴侣，通常在肿瘤组织中高表达。此外，热休克蛋白有助于肿瘤细胞的生长、繁殖和浸润[14]。CCND1是一种原癌基因，其过度表达可导致恶性细胞增殖，肿瘤形成[15]。ERBB2编码的蛋白质属于表皮生长因子受体家族，通过磷酸化激活MAPK和PI3K等下游蛋白质导致肿瘤的发生[16]。MYC基因作为一种原癌基因，在易位后具有高转录活性，在缺氧状态下可促进细胞恶性转化和肿瘤细胞代谢，从而削弱治疗对肿瘤细胞的致死作用，影响患者预后[17]。编码β-catenin 的癌基因CTNNB1在肿瘤细胞的生长和扩散中起重要作用，通过破坏β-catenin 复合物激活Wnt信号通路，研究发现CTNNB1的突变参与了癌症的发病机制[18-19]。p53蛋白是一种核磷酸化蛋白，在快速清除受损和潜在肿瘤细胞中起关键作用。p53突变后转化为癌基因，导致对细胞生长的失调。Voropaeva等的研究证实，TP53基因可能是淋巴瘤中有意义的预后生物标志物[20]。目前，大多数hub 基因已被研究参与许多经典的信号通路，如PI3K-Akt 和NF-κB 通路，但调控基因的miRNA(miRNA-326 和miRNA-375)在DLBCL中的作用有待进一步研究。
既往研究中，miRNA-326作为一种肿瘤抑制因子参与了多种肿瘤的病理过程，包括肺癌、结直肠癌、胶质瘤等[21-23]。而miRNA-375 在乳腺癌、结直肠癌和肺腺癌中过度表达，这可能促进肿瘤的发生[24-26]。相反，研究发现，血浆中的miRNA-326在正常组织中几乎检测不到，但在急性髓系白血病(AML)中大量存在[27]，且下调miRNA-375有助于AML中的肿瘤细胞增殖和集落形成[28]，与之一致，本研究亦发现DLBCL患者中miRNA-326 表达上调，miRNA-375 表达下调。然而，目前的研究仍存在一些局限性，对于miRNA-326、miRNA-375 及hub 基因的表达水平缺乏实验验证，尚需进一步分析。
综上，DLBCL 相关的miRNA 和hub 基因可能在DLBCL的发生发展中起重要作用。基于生物信息学分析，本研究成功地筛选出DLBCL血清中两个异常表达的miRNA(上调的miRNA-326和下调的miRNA-375)及其潜在的靶基因(AKT1、CCND1、ERBB2、TP53、MYC、CTNNB1和HSP90AA1)，为DLBCL 的机制研究提供了理论依据。
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