王亚男，梁岩岩，严文培，张银萍，李 强，吴秀菊
(东北农业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030)
O-甲基转移酶是一类调控植物次生代谢的关键酶，在木质素、类黄酮等次生代谢产物的合成与修饰中起着重要作用[1]。O-甲基转移酶催化的反应是将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基转移到底物的O-原子上，从而得到相应的甲基化产物[2]。一般根据OMT蛋白的大小和是否依赖二价阳离子辅助催化来进行分类，一类是催化过程依赖于金属离子的辅助且催化活性较小的OMT，另一类是常以二聚体的形式存在，催化过程不依赖金属离子即可发挥活性的OMT[3]。O-甲基转移酶家族具有5个保守结构域，Ⅰ～Ⅲ区参与S-腺苷蛋氨酸甲硫结合，Ⅳ区负责金属离子的结合， Ⅴ区参与催化[4]。
中药细辛在2020版《中国药典》中规定为马兜铃科植物北细辛(AsarumheterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.)、汉城细辛(A.sieboldiiMiq. var.seou1enseNakai)或华细辛(A.sieboldiiMiq.)的干燥根和根茎[5]，常用于痰饮喘咳、风寒感冒等症状[6]。自明代以来认为北细辛品质佳，并逐渐成为主流商品，延续至今[7]。北细辛主要分布在吉林、辽宁、黑龙江一带[8]，其主要活性物质是挥发油，基本在3%以下[9]，不同产地的挥发油成分均以甲基丁香酚与黄樟醚为主[10]。其中甲基丁香酚是通过苯丙烷代谢途径合成的[11]，其合成通路中的重要中间产物阿魏酸、松柏醛、松柏醇也用于合成木质素，而木质素的合成主要受咖啡酸O-甲基转移酶(Caffeic acid O-menthyl-transferase，COMT)和咖啡酰CoA O-甲基转移酶(Caffeoyl coenzyme A-O-methyltransferase，CCoAOMT)基因的调控[12]。Shaipulah 等[13]研究表明，在矮牵牛中沉默CCoAOMT基因会导致植株中花青素积累，并降低丁香酚的含量。这些研究结果表明，OMT在植物次生代谢通路中具有控制物质合成和调控物质流向的重要作用。
甲基丁香酚的生物合成最终是以丁香酚为底物，在丁香酚O-甲基转移酶(EOMT)的催化作用下完成[14]。目前仅在月季(Rosachinensis)、枇杷(Eriobotryajaponica)、罗勒(Ocimumbasilicum)、仙女扇(Clarkiabreweri)、苹果(Malusdomestica)和胡萝卜(Daucuscarota)中克隆得到具催化合成甲基丁香酚功能的O-甲基转移酶[15-20]。Gang等[14]研究表明，ObEOMT1催化丁香酚，也可催化胡椒酚与异丁香酚。胡萝卜DcE(I)OMT1可催化丁香酚、异丁香酚、胡椒酚，催化效率依次减弱，最适底物为丁香酚[20]。枇杷中分离得到4个OMT，其中EjOMT1的表达量随着花的发育增加，可以催化愈创木酚、异丁香酚、丁香酚、儿茶酚、阿魏酸、香兰素6种底物，愈创木酚为最适底物[16]。这些研究表明，以二聚体形式存在的OMT类可催化与最适底物结构相似的其他化合物，也验证了以丁香酚为底物进行体外酶活反应可以生成甲基丁香酚。
东北农业大学吴秀菊课题组前期围绕甲基丁香酚合成途径，基于本地北细辛转录组数据库，克隆得到PAL、C4H、4CL、CAD和EGS等甲基丁香酚合成相关酶基因[11，21]，但催化最后一步反应的丁香酚O-甲基转移酶基因尚未分离得到。为此，本研究拟筛选、克隆北细辛AhOMT1，进行生物信息学分析及原核表达分析，以期为体外酶活分析、基因功能研究及其代谢工程应用奠定基础。
1.1 试验材料
北细辛样本采自黑龙江省森林植物园药用植物园，保存于-80 ℃。
1.2 试验方法
1.2.1 总RNA的提取与cDNA第一链的合成 参照Trans Zolup Plus RNA Kit说明书提取北细辛总RNA，以微量分光光度计测定其浓度和纯度，并用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量，使用海基生物RT-PCR反转录试剂盒说明书得到cDNA。
1.2.2 北细辛OMT基因的筛选与克隆 以罗勒ObEOMT序列为参考，对转录组数据进行本地Blast，根据转录组数据库中基因表达信息及结构域预测分析进行筛选，将Contig_163作为OMT候选基因并命名为AhOMT1。以Contig_163为参考序列，使用 Primer Premire 5.0(Premier Biosoft)设计2对特异性引物(AhOMT1-1/2)，巢式PCR扩增出AhOMT1完整的ORF，引物序列如表1所示。
表1 PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR
以cDNA为模板，利用全式金TopTaqDNA聚合酶进行扩增，PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性25 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 个循环；
72 ℃，5 min。反应产物稀释100倍后用于第2轮PCR反应模板，反应程序同上。目的片段经回收纯化后连接至pEASY-T3 Vector，转化至DH5α，经菌液PCR鉴定后，挑取阳性菌株送至库美生物公司进行测序。
1.2.3 AhOMT1蛋白的生物信息学分析 采用ExPASyProtParam tool(http：//web.expasy.org/protparam/)分析基因编码蛋白的理化性质；
InterProScan(http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)分析基因编码蛋白的保守结构；
SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测蛋白的二级结构；
SWISS-MODEL(https：//www.swissmodel.expasy.org/)预测蛋白的三维结构；
TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和SignalP 5.0 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/servic-es /SignalP/)分析其跨膜结构域和信号肽。利用DNAMAN软件对测序结果进行比对以及AhOMT1蛋白序列与其他O-甲基转移酶蛋白序列的多重比对；
使用MEGA 6.0软件对AhOMT1蛋白序列与其他物种的O-甲基转移酶蛋白序列构建进化树。
1.2.4 AhOMT1原核表达载体构建、蛋白表达条件优化及纯化
1.2.4.1 原核表达载体的构建 利用Primer Premier 5.0设计引物在AhOMT1基因上下游引物5′端加入同源臂，引物序列如表1所示，使用高保真酶进行PCR扩增，扩增条件同2.2。将扩增的目的片段与经过BamH Ⅰ限制性内切酶进行单酶切的pET-32b载体通过同源重组酶进行连接，连接产物转化E..coliDH5α，进行菌液 PCR 和测序验证，保存阳性菌种并按照擎科试剂盒提取质粒。
1.2.4.2 AhOMT1原核表达条件的优化 将构建好的原核表达载体质粒转入 Rosetta(DE3)感受态细胞，将阳性菌落接种至4 mL LB液体培养基中(Amp：100 μg/mL)，37 ℃，200 r/min，过夜培养。次日以1∶50 比例转入50 mL LB液体培养基中相同条件培养至OD600达到0.4～0.6。加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG诱导蛋白表达，16 ℃，110 r/min培养16 h。菌液4 ℃离心，5 000 r/min，15 min，弃上清。2.5 mL细菌裂解液重悬菌体，冰上超声破碎，功率225 W，超声时间2 s，间隔时间5 s，破碎至菌液澄清，吸取全菌液备用。4 ℃破碎菌液，12 000 r/min离心5 min，分离上清与包涵体，吸取上清备用。2.5 mL细菌裂解液重悬沉淀，吸取重悬的沉淀备用。将5×Sample Buffer分别加入全菌液、上清与沉淀中，吹打混匀，沸水浴7 min，转至冰上，进行SDS-PAGE电泳。
将菌液培养至OD600为0.4～0.6，按1∶50的比例转入50 mL含有0.2 mmol/L IPTG的LB液体培养基中，分别置于16，28，37 °C继续培养4，8，16 h，SDS-PAGE电泳。
①糖尿病急性并发症如酮症酸中毒患者②严重的心肺肝肾功能异常③合并泌尿系、呼吸道等严重感染者④妊娠、哺乳妇女⑤继发糖尿病患者⑥1型糖尿病患者。
1.2.4.3 融合蛋白的纯化 采用康为世纪的His标签蛋白纯化试剂盒，对16 °C条件下诱导16 h的重组蛋白进行纯化，操作步骤详见试剂盒说明书，纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳。
2.1 北细辛OMT基因的筛选
基于本实验室前期得到的北细辛转录组数据库，以罗勒EOMT1基因序列作为探针，在转录组数据库中进行本地Blast搜索，筛选出21条相似序列。进一步通过保守结构域分析(图1)，发现具有完整ORF且包含OMT保守结构域的仅有3条Contig，即Contig_163、Contig_1153和Contig_3987。结合本地数据库相关信息分析得出(表2)，拟选择各部分表达水平(在根中表达量较高)与甲基丁香酚在北细辛中的分布趋势一致的Contig_ 163作为候选基因
图1 筛选基因的保守结构域分析Fig.1 Analysis of conserved domains of screening genes
。
表2 筛选到的OMT基因表达Tab.2 Expression of screened OMT gene
2.2 AhOMT1基因的克隆
以AhOMT1基因进行PCR扩增，经检测，扩增产物在1 000 bp处有单一亮带，与预计大小一致(图2)。对其进行胶回收，回收产物连接T3载体，转化大肠杆菌DH5α。阳性克隆菌液PCR验证结果如图2所示，菌液样本均在1 000 bp左右有单一亮带。测序结果显示，得到的AhOMT1的ORF序列长度为1 089 bp，与转录组中Contig_163的CDS序列完全相同。
M. Marker；
1—3.菌液PCR产物。
M. Marker；
1—3. Bacterial liquid PCR product.
2.3 AhOMT1蛋白的生物信息学分析
2.3.1 AhOMT1蛋白理化性质、功能域预测和亚细胞定位预测AhOMT1基因编码区含1 089个碱基，编码362个氨基酸，分子式为C1822H2849N463O530S16，预测分子质量是40.23 ku，等电点为5.34。该蛋白的不稳定系数为37.89，是稳定蛋白，脂肪系数96.13，亲水性平均系数为-0.002，推测为亲水性蛋白。亚细胞预测结果显示，AhOMT1定位于细胞质。
AhOMT1蛋白包含蛋白质二聚化结构域(氨基酸位置在第30—78位，IPR012967/PF08100)以及O-甲基转移酶结构域(氨基酸位置在第134—344位，IPR001077/PF00891)，属于第一类O-甲基转移酶(图3)。
图3 AhOMT1蛋白结构域分析Fig.3 AhOMT1 protein domain analysis
2.3.2 AhOMT1蛋白结构、信号肽和结构域分析 用 SOPMA 在线软件对AhOMT1蛋白进行二级结构预测，发现该蛋白的α螺旋比例为46.69%，延伸链比例为13.81%，β折叠比例为6.63%，无规则卷曲比例为32.87%。由此，该基因编码的蛋白二级结构为无规则卷曲型。使用同源建模工具SWISS-MODEL预测AhOMT1蛋白的三维结构模型，结果如图4所示，以苜蓿(Medicagosativa)的异黄酮-O-甲基转移酶的晶体三维结构为模板(SMTL ID：1fp2.1.A)，在AhOMT1第10—362位氨基酸残基建模1，相似性为44.84%，GMQE值为0.73，QMEAN值为-1.75。AhOMT1蛋白底物结合口袋衬有芳香族和脂肪族氨基酸侧链，为底物结合提供了疏水环境，与SAM相互作用的氨基酸残基为Ser-179、Gly-205、Gly-207、Leu-229、Asp-248、Met-249、Lys-262、Asp-267。
利用SignalP 5.0 Server在线软件，预测AhOMT1的信号肽平均值为0.000 8，不具有信号肽及切割点，为非分泌蛋白。利用 TMHMM Server v2.0在线软件对AhOMT1蛋白的跨膜结构域进行分析，结果显示其为膜外蛋白，无跨膜区。
A，B.以MsIOMT为模板的预测结构；
B中蓝色为脂肪族氨基酸残基。
A，B. Forecast structure using MsIOMT as template；
The blue in B is aliphatic aliphatic amino acid residues.
2.3.3 AhOMT1蛋白的同源比对及系统进化树分析 与其他植物的OMTs进行氨基酸序列比对，结果如图5所示，在紫花苜蓿异黄酮O-甲基转移酶(MsIOMT)晶体结构的报道中，MsIOMT的His-257负责将底物的芳香族羟基去质子化，并在底物甲基化过程中引发对SAM的双分子亲核取代反应(Sn2)，Asp-288和Glu-318在空间结构上以及通过氢键结合的方式限制了His-257，从而促进了有效的催化作用[22]。这些氨基酸残基在AhOMT1中是保守的，表明它们也是AhOMT1中的催化残基。此外，AhOMT1蛋白在O-甲基转移酶家族的保守区域Box I—Box V也相对保守。
Ah.北细辛；
Ms.紫花苜蓿；
Ob.罗勒；
Cb.仙女扇；
Ej.枇杷；
Dc.胡萝卜；
Md.苹果；
*.催化残基。
Ah.Asarum heterotropoides；
Ms.Medicago sativa(FP2A)；
Ob.Ocimum basilicum EOMT1(AAL30424)；
Cb.Clarkia breweri IEMT1(AAL01533)；
Ej.Eriobotrya japonica(BAV54107.1)；
Dc.Daucus carota(XP_017238865.1)；
Md.Malus domestica(AKN09016.1)；
*.Catalytic residue.
AhOMT1编码的蛋白与不同植物的OMT蛋白进化关系如图6所示，这些氨基酸序列根据同源性被分为2类，第1类几乎为COMT或从COMT进化来的酶(如CbIEMT)，第2类为可催化黄酮、异黄酮以及丁香酚等底物的OMT，AhOMT1归为第2类。
2.4 pET-23b-AhOMT重组表达载体的构建
将AhOMT1ORF通过同源重组的方法插入经BamH Ⅰ单酶切的pET-32b载体，连接后转化至大肠杆菌DH5α，挑取单克隆菌落进行PCR检测，均为阳性克隆(图7)，经测序与酶切电泳检测，结果表明，正向测序结果与AhOMT1序列比对一致，无碱基突变情况，说明目的片段与pET-32b载体连接成功并且插入方向正确。
进化树类型为NJ(Neighbor-joining)树，Bootstrap 取样值为1 000；
结点的Bootstrap value评估该分支的可信度。
The evolutionary tree type is NJ(Neighbor-joining)tree，and the bootstrap sampling value is 1 000；
The Bootstrap value of the node evaluates the credibility of the branch.
M.DNA Marker；
1—4.菌液PCR产物；
5.未酶切pET-32b质粒；
6.单酶切pET-32b质粒；
7.pET-32b-AhOMT1重组质粒。
M. DNA Marker；
1—4. Bacterial liquid PCR product；
5.pET-32b digested with enzyme；
6.Non-digested pET-32b；
7.pET-32b-AhOMT1 recombinant plasmid.
2.5 AhOMT原核表达条件优化和纯化
将阳性重组质粒pET-32b-AhOMT1转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态，为了使pET-32b-AhOMT1重组质粒融合蛋白在上清中表达量更高，对诱导温度进行了优化。对重组载体进行不同温度(37 ℃，4 h；
28 ℃，8 h；
16 ℃，16 h)的诱导，并由SDS-PAGE检测蛋白的表达。AhOMT1与pET-32b载体上的标签蛋白进行融合表达时的分子质量约为60 ku。如图8-A—C所示，pET-32b-AhOMT1重组质粒经诱导后在55～70 ku有一条明显的条带，与预期大小一致。随着诱导温度的降低，菌液上清中的表达量逐渐增大，因此选择16 ℃、16 h作为最佳诱导条件。最佳诱导条件得到pET-32b-AhOMT1重组质粒融合蛋白，所得上清液以镍柱进行纯化，如图8-D所示，咪唑浓度为100，200，300 mmol/L AhOMT1蛋白被洗脱下来，相比较而言，咪唑浓度为200 mmol/L洗脱蛋白量最大。
北细辛是我国东北地区重要的药用植物，现以根和根茎入药[23]，含有挥发油(以甲基丁香酚为主)、细辛脂素、黄酮类等成分，具有解表散寒[24]、镇痛消炎[25]等药理活性，在治疗新型冠状病毒肺炎的通用方剂清肺排毒汤中就含有细辛这一味中药[26]，李静团队对湖北省近万例病历进行了整理分析，结果显示，我国新冠肺炎诊疗方案持续推荐和临床广泛使用的清肺排毒汤可使得新冠肺炎住院患者的死亡率下降1/2[27]。但近年来北细辛野生资源急剧减少，人工繁殖又存在生长周期长、有效成分的积累易受环境条件影响等问题，且大量研究结果表明，北细辛的挥发油量仅在3%左右[9]，作为主要成分的甲基丁香酚含量更低，一定程度上限制了其在临床上的应用。如能解析主要活性成分如甲基丁香酚代谢途径，获得合成相关酶基因，通过代谢工程方式将有望缓解供需矛盾。
A.37 ℃，4 h；
B.28 ℃，8 h；
C.16 ℃，16 h；
D.pET32b-AhOMT1蛋白纯化；
M.蛋白Marker；
1.空载对照诱前总蛋白；
2.空载对照诱后总蛋白；
3.重组蛋白诱前总蛋白；
4.重组蛋白诱后总蛋白；
5.重组蛋白诱后上清；
6.重组蛋白诱后包涵体；
7—11.咪唑浓度分别为100，200，300，400，500 mmol/L洗脱的蛋白。
根据已知的苯丙素类(甲基丁香酚)生物合成途径[13]及本地转录组数据库[28]，东北农业大学吴秀菊课题组已成功分离了北细辛PAL、C4H等相关酶基因[21]。以已报道的罗勒EOMT1序列为参考，对本地转录组数据库进行Blast分析，在北细辛转录组数据库中筛选到21条相似序列，进一步通过NCBI线上预测基因功能结构域以及候选基因的相对表达量 RPKM 分析，AhOMT1在各器官中的表达水平与甲基丁香酚在北细辛中的分布相似，因此，以Contig_163的CDS序列为参考序列，设计特异性引物，在北细辛中成功克隆得到1个OMT基因，命名为AhOMT1，蛋白结构域分析表明，其为SAM依赖性甲基转移酶，属于OMT家族，具二聚化结构域，并且进行甲基化反应时不依赖金属离子的一类OMT。通过不同植物OMT蛋白同源比对发现，AhOMT1与其他具有催化丁香酚或丁香酚结构类似底物的OMT在O-甲基转移酶共识区相对保守，本研究以紫花苜蓿的IOMT为模板，将AhOMT1进行三维结构建模，发现预测结构以二聚体形式存在，活性部位可与SAM相互作用，负责稳定底物的氨基酸为色氨酸，与CbIEMT一致。
原核表达常用于体外基因功能验证，也是研究花香代谢途径相关基因酶功能的常用方法。本研究对AhOMT1蛋白亲水性进行预测，结果显示，该蛋白为亲水性蛋白，这表明该蛋白更大可能是以可溶性蛋白形式存在。一般通过调节诱导剂浓度、诱导时间的长短和温度来获得更多的可溶性蛋白。在不同物种中，具有相同功能的蛋白可能需要不同的诱导条件，如胡萝卜DcOMT1蛋白的诱导条件为30 ℃，0.5 mmol/L IPTG诱导12 h[20]；
罗勒ObEOMT1蛋白以0.3 mmol/L的IPTG[22]，室温过夜诱导；
枇杷MjOMT1蛋白则以16 ℃，0.5 mmol/L的IPTG诱导12 h[16]。本研究在进行AhOMT1原核表达时，设置了3个温度，其中16 ℃，0.2 mmol/L的IPTG诱导12 h可获得较大量可溶性蛋白，为最佳诱导条件，使AhOMT1基因体外高效表达成为可能，也为体外酶活体系建立奠定基础。使用镍柱分离纯化重组AhOMT1蛋白，得到纯化后的AhOMT1蛋白，其中咪唑浓度为200 mmol/L洗脱蛋白量最大。
本研究对北细辛转录组数据库进行筛选，通过巢式PCR获得北细辛AhOMT1CDS序列，成功构建原核表达载体pET-32b-AhOMT1，并确定了获得较大量可溶性蛋白的最佳诱导条件：16 ℃，0.2 mmol/L的IPTG诱导12 h，成功分离纯化得到单一的AhOMT1 重组蛋白，研究结果为后续对AhOMT1基因的功能鉴定提供了理论基础。
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