崔翰博，褚月颉，苏明，关怿，任永丽
（天津市中医药研究院附属医院，天津 300120）
糖尿病大血管并发症（DMC）是因糖代谢等异常导致的发生于动脉血管的动脉粥样硬化性病变，其病理可见泡沫细胞形成、动脉内膜增厚、粥样硬化斑块形成，甚至动脉血管闭塞等。常见的危险因素包括年龄、性别、高血压、吸烟、体质量指数、病程、血脂等因素[1]。最新的流行病调查显示中国成年人糖尿病发病率已达11．2%[2]，而仅是属于糖尿病大血管病变的心血管病变就占到糖尿病患者65%的死亡原因[3]。因此预防其大血管并发症的发生和发展具有重要意义。
补脾胃泻阴火升阳汤出自李东垣《脾胃论》，是甘温除热法代表方剂之一。甘温除热法指采用味甘性温的药物来治疗某些虚性热证（即阴火）的治法。通过临床观察和实践专家们认为糖尿病及其并发症的形成和发展与阴火具有密切联系，治疗中以本方化裁干预，发现其在协助稳定血糖的同时对糖尿病大血管并发症也具有较好的预防作用。本研究通过观察补脾胃泻阴火升阳汤对肠道菌群、氧化三甲胺（TMAO）及相关血管损伤标记物等的影响，初步探索糖尿病大血管并发症的形成与阴火损伤的可能关联，探讨甘温除热法对糖尿病血管并发症可能的保护机制。
1.1 动物及分组 雄性Hartley豚鼠（300～400 g）36只，6周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。室温（22±2）℃，保持安静。考虑到预实验中豚鼠糖尿病模型病死率较高，在分组时增加模型组与干预组样本量。按照随机数字表法分为空白组6只、模型组14只、干预组16只。
1.2 主要试剂 链尿佐菌素（STZ）Solarbio-301A025；
酶联免疫吸附法试剂盒豚鼠TMAO（货号：TAE-833g）、脂多糖（LPS，货号：TAE-261g）、肿瘤坏死因子（TNF）-α（货号：TAE-569g）、细胞间黏附分子（ICAM）-1（货号：TAE-362g）、血管细胞黏附分子（VCAM）-1（货号：TAE-576g），以上均购自天津安诺瑞康生物技术有限公司。肠道菌群检测委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司检测。
1.3 主要仪器 酶标仪：北京普朗科技有限公司，型号：DNM-9602；
纯水仪：宁波丹斯博，型号：CANSH；
恒温箱：上海一恒，型号：DHP9121B。
2.1 模型制备 包括动脉粥样硬化造模和糖尿病造模。
2.1.1 动脉粥样硬化造模 对“模型组”和“干预组”饲喂高脂饮食以诱导动脉粥样硬化。在适应性喂养5 d后进行，持续至实验结束。高脂餐配方：2%胆固醇，0．3%胆酸钠，10%猪油，87．7%普通豚鼠饲料。
2.1.2 糖尿病造模 饲喂高脂饮食1周后对“模型组”和“干预组”采用中小剂量多次腹腔注射STZ诱导其产生糖尿病。STZ注射浓度45～150 mg/kg（采用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，调整 pH 至 4．2～4．6，STZ浓度为10 mg/mL）；
空白组腹腔注射相同标准体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。考虑到预实验中豚鼠死亡率较高，以及空腹时低血糖带来的死亡率。1周后复测随机血糖（RBG）高于7．8 mmol/L的样本为合格。对不合格样本予以重复造模，1周后重复1次，3次仍不能成模样本予以剔除。
2.2 药物制备及干预方法 补脾胃泻阴火升阳汤组成及用量如下：黄芪20 g，党参15 g，柴胡20 g，升麻 12 g，麸炒苍术 15 g，羌活 15 g，黄芩 10 g，黄连10 g，石膏15 g，甘草15 g。以上各味药物饮用水浸泡30 min，煎煮两次，每次30 min，得药汁后以65℃水浴浓缩至 200 mL（相当于 0．735 g 生药/mL），经动物体表面积折算豚鼠等效剂量为13 mL/（kg·d）。
“干预组”采用中药汤剂每日1次灌胃，“模型组”及“空白组”采用等剂量生理盐水灌胃。中药干预从适应性喂养结束后开始，持续7周。
2.3 样本采集 干预第7周末，动物空腹6 h后麻醉，立即开腹下腔静脉取血，制备血清备检；
处死动物后手术切取主动脉弓，立即浸入固定液，以备制片（HE染色切片交由易生源检测技术服务有限公司）。切开结肠收集粪便样本于无菌粪便盒中，提取总DNA后送检16S rDNA扩增子测序。
2.4 肠道菌群检测及分析 PCR扩增后基于Illumina Nova测序平台测序，构建PCR-free文库，然后进行双末端（Paired-End）测序。通过对Reads拼接，测得每样本tags总量，将质控后获得的有效数据以97%的一致性（Identity）将序列聚类成为分类单位（OTUs），然后对OTUs序列与Silva138数据库进行物种注释。根据所有样本在属水平的物种注释及丰度信息，选取丰度排名前35的属，根据其在每个样本中的丰度信息，从物种和样本两个层面进行聚类，绘制成热图，便于发现哪些物种在哪些样本中聚集较多或含量较低。
2.5 统计学分析 数据分析采用SPSS 19．0统计软件处理，各组数据以均值±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SN-K检验，P＜0．05为差异有统计学意义。
除去死亡脱落和剔除未成模动物后，空白组6只，模型组8只、干预组9只。对以上样本进行数据统计。
3.1 对空腹血糖（FBG）、随机血糖、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）水平的影响 与空白组比较，干预组FBG 显著升高（P＜0．01）；
模型组 FBG 与空白组比较无统计学差异（P＞0．05）；
与空白组比较，模型组与干预组 RBG 水平明显升高（P＜0．01）；
3组间 TC、TG 水平无统计学差异（P＞0．05）。见表1。
表1 对DMC豚鼠血糖、血脂的影响Tab.1 Effects on blood glucose and blood lipid of DMC guinea pigs
3.2 对 TMAO、LPS、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 水平的影响 与空白组、干预组比较，模型组TMAO水平明显升高（P＜0．01）；
空白组与干预组间 TMAO水平无统计学差异（P＞0．05）。与空白组比较，模型组LPS、VCAM-1 水平明显升高（P＜0．05）。但在空白组与干预组间、模型组与干预组间均无统计学差异（P＞0．05）。3组间TNF-α、ICAM-1水平无统计学差异（P＞0．05）。见表2。
表2 对DMC豚鼠的TMAO、LPS、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1影响Tab.2Effects on TMAO，LPS，TNF-α，ICAM-1，VCAM-1 of DMC guinea pigs
3.3 对肠道菌群的影响 通过对Reads拼接，平均每样品测得101 622条tags，经过质量控制平均得到100849条有效数据，质控有效数据量达63 826，质控有效率达62．84%。以97%的一致性（Identity）将序列聚类成为OTUs，共得到4 807个OTUs，然后对OTUs序列与Silva138数据库进行物种注释。注释结果中，共有1 477（30．73%）个OTU注释到属水平。
在门水平上，占据主导地位的主要包括Bacteroidota（拟杆菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）、Proteobacteria（变形菌门）；
在纲水平上主导的为Bacteroidia（拟杆菌纲）、Clostridia（梭状芽孢杆菌纲）、Gammaproteobacteria（γ亚群变形菌纲）；
在目水平上的优势物种为Bacteroidales（拟杆菌目）、Clostridia_UCG-014（梭状芽孢杆菌目）、Oscillospirales（颤螺菌目）；
在科水平上的优势物种为 Muribaculaceae、Lachnospiraceae（毛螺菌科）、Ruminococcaceae（瘤胃菌科）；
在属水平上的优势物种为 Ruminococcus（瘤胃球菌属）、Parasutterella（副萨特氏菌属）、Akkermansia（阿克曼菌属）；
优势种为Bifidobacterium_magnum（双歧杆菌）、Bacteroides_dorei（多雷拟杆菌）、Bacteroides_acidifaciens（产酸芽孢杆菌）。
肠道菌群丰度聚类图如图1所示，。在属水平上，通过heatmap图可从整体上展示差异物种在各组间的分布情况，该图不仅能够展示出某一物种在样本中的丰度信息，还给出了该物种在组间的显著性检验结果。结果显示：与空白组比较，模型组的Ruminococcus（P＜0．01）、Arthrobacter（节杆菌属）、Solirubrobacter（土壤红杆菌属）、Ileibacterium、Alistipes（理研菌属）、Faecalibacterium（粪杆菌属）丰度显著降低（P＜0．05）；
UCG-005（P＜0．01）、Methanobrevibacter（甲烷短杆菌属）、achnospiraceae（毛螺菌科）_NK4A136_group、Colidextribacter、Akkermansia丰度显著增高（P＜0．05）。较模型组，干预组的 Arthrobacter、Solirubrobacter（P＜0．01）、Lactobacillus（乳酸菌）、Colidextribacter、Papillibacter、Christensenellaceae（克里斯滕森菌科）_R-7_group、Desulfovibrio（脱硫弧菌）丰度显著降低（P＜0．05）；
Faecalibacterium 丰度显著增高（P＜0．01）。见图2。
图1 各组肠道菌群丰度聚类图Fig.1 Cluster diagram of intestinal flora abundance in each group
图2 各组肠道菌群丰度heatmap图Fig.2 Heatmap of intestinal flora abundance in each group
3.4 对主动脉石蜡切片HE染色的影响 空白组内膜光滑，平滑肌细胞排列整齐清稀（见图3a、3b、3c）。模型组可见平滑肌细胞中散见较多空泡样变性（图中横线标示处），在中膜外层和外膜尤为明显，未见明显泡沫细胞形成（见图3d、3e、3f）。干预组可见少量空泡样变性，较模型组明显减少，未见泡沫细胞（见图3g、3h、3i）。
图3 各组主动脉弓石蜡切片HE染色（×400）Fig.3 HE staining of paraffin sections of aortic arch in each group（×400）
糖尿病属于中医消渴病范畴。消渴病病机为李东垣所提出的“阴火”证范畴，而“脾虚精微不呈、心肺阴虚生火”为其基本病机[4]。《脾胃论》曰：“盖阴火上冲，则气高而喘，为烦热、为头痛、为渴、为脉洪”。《内外伤辨惑论》曰“致阴火上冲，作蒸蒸燥热”。可见李东垣所述烦、渴、燥热等阴火见症皆可见于消渴。脾胃受损升降失序为阴火的病机基础：脾不升清，津液失布，传化失常而为腹胀、便秘、大便黏腻、便溏腹泻[5]、舌苔厚腻等症。消化系统症状的聚集预示着与肠道菌群之间的密切联系。消渴病阴火熏灼脉络、日久脉络损伤进而导致血管并发症。李东垣指出“血中伏火”与“阴血伏火”，阴火潜藏在血络中，损伤阴液，日久生痰致瘀，形成糖尿病血管并发症[6]甚至下肢动脉闭塞[7]。由此笔者提出“阴火致消”与“阴火致变”理论。
据报道，高脂饮食喂养的豚鼠可在8周形成动脉粥样硬化斑块[8]，本实验中仅观察到空泡样变性而未见有泡沫细胞形成，可能是受限于造模的时间。同时模型组VCAM-1水平升高，提示存在动脉损伤。干预组空泡样变性较模型组减少，VCAM-1水平下降并接近空白组水平，提示动脉损伤相对减轻。研究发现合并糖尿病的冠心病患者中拟杆菌门丰度较低，而厚壁菌门和变形菌门显著增高；
有益菌或共生菌（如普氏栖粪杆菌和脆弱拟杆菌）明显减少，机会致病菌（如肠杆菌科、链球菌和脱硫弧菌）明显增多[9]。本实验中也观察到了中药干预后粪杆菌属丰度的增高和致病菌脱硫弧菌属丰度的减低，但中药干预组有益菌乳酸菌丰度降低，提示一定程度上改善了肠道菌群结构但与正常菌群仍有所不同。肠道菌群发生紊乱时可能造成肠壁通透性增加和LPS进入机体环境并诱发慢性炎症和动脉内膜的损伤。模型组可见LPS显著升高，而中药干预组LPS水平的降低可能与其调节肠道菌群失衡有关。2型糖尿病患者的肠道菌群紊乱导致TMAO产生增多，预示着不受传统危险因素、肾功能和血糖控制关系影响的较高的主要心脏不良事件（3年主要心脏不良事件风险增加3．0倍）和死亡风险（5年死亡风险增加3．6倍）[10]。通过TMAO处理16周的SAMR1小鼠和 SAMP8小鼠观察到 SA-β-gal、p53、p21衰老标记物的高表达以及血管功能障碍和重构，这可能与抑制SIRT1表达和氧化应激增加，从而激活p53/p21/Rb通路有关[11]。因此，TMAO被认为与糖尿病血管并发症的发生密切相关。本实验中，模型组TMAO水平显著升高、肠道菌群较空白组出现显著差异而通过补脾胃泻阴火升阳汤干预后TMAO水平显著降低至接近正常水平，可能与干预组较轻的血管病变有关。紊乱的肠道菌群通过增加TMAO的产生，加速了动脉的损伤[12]。
模型组FBG均值与空白组接近，但离散度很大，因部分个体出现空腹低血糖所致（最低致2．2 mmol/L），提示血糖波动性较大，而中药干预后则未见空腹低血糖的情况。近年来，血糖波动也被认为是糖尿病血管损伤的重要原因[13]。因此，该模型血管并发症的形成与血糖波动也有一定联系。同时也印证了甘温除热法对于预防糖尿病血糖或血糖波动方面潜在的疗效[14]。脾胃乃精微运化之枢，阴火证脾胃损伤精微下流可能是产生血糖波动的原因[15]。培补中焦使精微能够上呈从而避免了低血糖的发生[16]和减少了血糖波动[17]，延缓了血管并发症的进展。此外，模型组血脂（TC、TG）略有升高但并无统计学差异，提示血脂异常可能并非该模型动脉损伤的原因，同时本方的血管保护作用也并非通过调节血脂水平达到的。
阴火证脾胃损伤、湿热内盛的病机或许与肠道菌群失调状态有关[18]；
实验中观察到模型组肠道菌群结构显著变化，而肠道菌群紊乱的临床表现可能包括舌苔的变化、大便性状或节律的改变等，这一点也符合脾胃虚损这一阴火的病机基础。阴火鸱张，血中伏火熏灼络脉，可能与现代医学低度炎症有关[19]；
精微耗损与虚热灼损为其血管并发症形成的关键。李东垣谓：“今饮食损胃，劳倦伤脾，脾胃虚则火邪乘之，而生大热，当先于心分补脾之源。盖土生于火，兼于脾胃中泻火之亢甚，主生化之源”。方中黄芪、人参补脾胃之伤，化生营气之源，以济心肺而熄阴火之燔灼；
苍术、羌活燥湿，祛“脾胃下流之湿气”；
柴胡、升麻升阳醒脾，助精微清阳上呈心肺；
酌以黄芩、黄连、石膏以除阴火之燔灼。补脾胃泻阴火升阳汤令精微上呈，阴火消熄则不复灼烧脉络，从而延缓了糖尿病血管并发症的发生。