张翼华， 张志凌
(武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉 430072)
新型冠状病毒于2019年12月首次发现，国际病毒分类委员会(ICTV)将其命名为SARS-CoV-2。该病毒感染人体后会导致致命急性呼吸窘迫综合症(ARDS)，以及心脏病、多器官功能障碍和突然死亡[1]。新冠病毒的组成主要包括结构蛋白和遗传物质单链RNA和其他非结构蛋白以及附属蛋白[2]。结构蛋白包括刺突(S)蛋白、包膜(E)蛋白、基质(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白四种[3]。目前的检测方法主要有核酸检测、抗原检测和抗体检测以及病毒粒子检测四大类[4]。核酸检测一般是对病毒遗传物质RNA的全基因组或基因片段进行检测。实时聚合酶链式反应(RT-PCR)特异性强，灵敏度高，是冠状病毒检测的常规方法[5-7]，也是新冠病毒检测的金标准[8]。新冠病毒不断变异，且该方法样品前处理步骤繁琐，增大样品污染机会，导致产生假阴性和假阳性结果[9]。特异性抗体一般在患者感染病毒一周之后才能检测出来[10]，且抗体并非仅在感染者体内出现，治愈者和疫苗接种者体内也会出现。抗体检测不能单独作为确诊依据。
抗原检测是对病毒特异性蛋白，包括S蛋白和N蛋白的检测。S蛋白检测常会涉及病毒粒子的直接暴露[11]，具有一定危险性。N蛋白是新冠病毒最丰富的结构蛋白，参与病毒转录和复制，并在宿主细胞内帮助病毒颗粒的产生和释放[12,13]。N蛋白具有免疫原性[14]，在感染过程中大量表达，抗原性好[15]。目前已有多种N蛋白的检测方法报道。N蛋白适配体[16]和单域抗体[17]都被用于N蛋白的检测。微流控技术[18]和CRASPR/Cas12a技术[19]也被用于N蛋白检测中的信号放大。本文合成了一种比色荧光纳米球，结合侧向层析技术实现了N蛋白比色定性检测及荧光定量检测。单个纳米球含有多个金纳米粒子和量子点，可实现检测信号放大。
1.1 主要仪器与试剂
紫外光谱仪(UV-2550,Shimadzu)；
荧光光谱仪(Fluorolog -3,Horiba Jobin Yvon)；
粒度仪(ZS -ZEN 3600,Malvern)；
荧光倒置显微镜(TE2000-U,Nikon)；
凝胶成像仪(EN61010,Alpha Innotech)；
透射电子显微镜(JEM-2100F，Hitachi)；
分析天平(AT20,Mettler-Toledo)。
新冠病毒重组N蛋白(2.2 mg/mL)、小鼠抗新冠病毒IgG -A(6.2 mg/mL)和小鼠抗新冠病毒IgG -H(6.0 mg/mL)均购自杭州索莱尔博奥生物技术有限公司。羊抗鼠IgG(10 mg/mL)购自北京索莱宝科技有限公司。525 nm绿色荧光球(5 mg/mL)购自武汉珈源量子点有限公司。牛血清白蛋白(BSA)购自德国Biofroxx公司。胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、聚乙烯亚胺(PEI)、Tween 20、硅酸四乙酯(TEOS)和3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)购自Sigma-Aldrich公司。N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自Thermo公司。实验用水为超纯水。
1.2 比色荧光纳米球的制备
金纳米粒子由Frens法[20]制备。取100 μL荧光纳米球(FNs)，加入100 μL的EDC(10 mmol/L)、100 μL NHS(10 mmol/L)和100 μL PEI(40 mg/mL)。摇床反应12 h。将产物用0.5 mol/L NaCl溶液和超纯水各洗涤4次(13 000 r/min、15 min)，分散于超纯水得到FNs@PEI。将金纳米粒子缓慢分次滴加至FNs@PEI中，滴加完用超纯水洗涤2次，再分散于200 μL超纯水，得FNs@PEI@AuNPs。按文献方法[21]硅烷化,得FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES。将该材料用DMF洗涤3次后，分散到3 mL DMF中，加入1 mL的SA的DMF溶液(0.02 g/mL)，摇床室温反应3 h，用乙醇和超纯水各洗涤3次，分散于200 μL超纯水中，即得羧基化的比色荧光纳米球(FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES@SA)。
1.3 比色荧光纳米球抗体偶联
将比色荧光纳米球用0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=6.8)离心洗涤2次后，分散于200 μL PBS中，依次加入100 μL EDC(10 mmol/L)和100 μL NHS(10 mmol/L)溶液，室温摇床(150 r/min)活化20 min。离心(13 000 r/min、15 min)去掉上清，并用PBS(0.01 mol/L，pH=7.2)离心洗涤1次。将沉淀用400 μL PBS重悬，加入10 μL小鼠抗新冠病毒IgG -A，室温摇床(150 r/min)反应12 h。离心(13 000 r/min、15 min)去掉上清，用200 μL PBS离心洗涤3次。产物用200 μL PBS重悬，即得比色荧光免疫纳米球(FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES@SA@Antibody)。用一定浓度的BSA封闭免疫纳米球后，存于4 ℃冰箱，待用。
1.4 侧向层析法检测新冠病毒重组N蛋白
将10 μL 0.32 mg/mL比色荧光免疫纳米球、10 μL重组N蛋白和80 μL(20 mmol/L Na3PO4，5%BSA，0.25%Tween 20，10%蔗糖)加至96孔板混合后，滴加到试纸条样品垫上，层析25 min后，读取信号。
2.1 新冠病毒N蛋白侧向层析检测原理
如图1所示，层析试纸条T线为小鼠抗新冠病毒IgG -H。IgG -A、IgG -H可通过亲和作用识别N蛋白的不同位点。C线羊抗鼠IgG能结合未与N蛋白结合的比色荧光免疫纳米球。层析之后，若存在目标物，T/C线处会同时出现金纳米粒子的比色信号和量子点的荧光信号，可分别用于定性和定量检测。
图1 新冠病毒N蛋白侧向层析检测原理Fig.1 Design of lateral chromatography for the detection of novel coronavirus recombinant N protein
2.2 比色荧光免疫纳米球的表征
如图2所示，荧光纳米球表面偶联带正电荷的PEI后，通过静电作用吸附带负电荷金纳米粒子，加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)反应过夜，超纯水洗涤后，加入氨水和TEOS水解，再加入APTES形成Si-O-Si键，使纳米球表面带-NH2。再加入丁二酸酐与氨基反应实现纳米球表面羧基化。最后加入EDC和NHS使羧基与抗体的氨基偶联制备得到比色荧光免疫纳米球。
图2 比色荧光免疫纳米球的制备过程Fig.2 Diagram of preparation process of colorimetric fluorescent immunonanospheres
采用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱和动态光散射对纳米球进行监测。如图3A所示，FNs无明显吸收峰，而组装上金纳米粒子后，在530 nm处出现吸收峰，相较于AuNPs(520 nm)有一定红移。图3B表面组装过程中FNs的荧光峰位置没有变化，强度仅有小幅降低。如图3C和3D所示,FNs表面偶联上PEI后，水合粒径由109 nm增大至121 nm，表面电势也由-30 mV变为+42 mV，利用静电作用可吸附纳米金。FNs@PEI@AuNPs的表面电势负移为-16 mV，水合粒径增大至179 nm。电镜结果(图3E)显示每个荧光球可偶联约20～50颗纳米金。TEOS硅烷化后，纳米球的水合粒径增大至188 nm，表面电势降低至-42 mV。进一步APTES硅烷化后，因APTES氨基带正电荷,电势正移至+39 mV，水合粒径为187 nm几乎不变。纳米球与丁二酸酐(SA)反应后，纳米球(FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES@SA)表面的羧基化使表面电势负移至-24 mV，水合粒径进一步增大至230 nm，其形貌如图3F所示。最后通过氨基和羧基偶联抗体得到FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES@SA@Antibody，水合粒径和表面电势仍保持在230 nm和-24 mV。
图3 比色荧光免疫纳米球合成过程中的紫外-可见吸收光谱(A)、荧光光谱(B)、水合粒径(C)和表面zeta电势(D)。FNs@PEI@AuNPs(E)和FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES@SA(F)的电镜图。Fig.3 UV-Vis absorption spectra(A),fluorescence spectra(B),hydrated particle sizes(C) and zeta potentials(D) of nanospheres during the synthesis of colorimetric fluorescence immunonanospheres.Transmission electron microscopy images of FNs@PEI@AuNPs(E) and FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES@SA(F).(C)and(D):a.FNs;b.FNs@PEI;c.FNs@PEI@AuNPs;d.FNs@PEI@AuNPs@TEOS;e.FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES;f.FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES@SA;g.FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES@SA@Antibody.
2.3 比色荧光纳米球抗体偶联的表征
如图4所示，与Cy3标记的羊抗鼠IgG孵育后，在绿色通道可见量子点的荧光信号(图4A)，且红色通道有明显的Cy3荧光(图4B)。表明两者有很好的荧光共定位。用Image J计算的曼德斯共定位系数为0.805，共定位效果良好，说明IgG -A抗体成功偶联到比色荧光球上。而当纳米球表面没有偶联IgG -A抗体时，仅有量子点绿色荧光(图4D)，而没有红色荧光(图4E、4F)。
图4 与Cy3标记羊抗鼠IgG孵育的比色荧光纳米球荧光成像图Fig.4 Fluorescence images of nanospheres incubated with Cy3 labelled goat antimouse IgG
2.4 实验条件的优化
由图5A可见，随着封闭剂浓度增加，阳性信号随之减弱，阴性信号先增加后减小。综合考虑选择10%BSA作为封闭剂。比色荧光免疫纳米球的浓度也对层析检测有影响。结果表明，纳米球浓度为0.32 mg/mL时，信背比最大，且阳性信号强(图5B)，因此确定纳米球的最佳浓度为0.32 mg/mL。如图5C所示，在优化的封闭剂和纳米球浓度下，25 min时阳性信号最大且信背比较大。
图5 侧向层析条件优化。(A)封闭剂BSA浓度，(B)纳米球浓度，(C)层析时间。Fig.5 Optimization of lateral chromatographic conditions.(A) Concentration of BSA,(B) Concentration of nanospheres,(C) Testing time.
2.5 方法的分析性能
2.5.1 线性范围和检测限在0.01 mol/L的PBS(pH=7.2)中，考察了方法的线性范围和检测限。由图6A可见，随着N蛋白浓度降低，T线的荧光强度依次降低。同样T线比色信号(图6B)也不断降低。N蛋白浓度在8.9～1.8×102nmol/L范围内，均出现量子点荧光信号和金纳米粒子比色信号，并且荧光信号强度的对数和N蛋白浓度的对数呈线性关系(图6C)，检测限为2.1 nmol/L。
图6 不同N蛋白浓度时的试纸条荧光图(A)、比色图(B)和荧光检测线性关系(C)Fig.6 Fluorescence images(A) and colorimetric images (B) of testing strips with different concentrations of N protein;Logarithmic relationship between fluorescence intensity and concentration of N protein(C)
2.5.2 特异性禽流感病毒H5N1(1.0 mg/mL)、H7N9(3.1 mg/mL)和日本脑炎病毒(JEV,3.5 mg/mL)的信号远低于新冠病毒N蛋白(0.055 mg/mL)的信号。结果说明方法具有很好的特异性。如图7所示。
2.5.3 重现性分析利用同一批次和不同批次的比色荧光免疫纳米球，考察了方法的组内和组间重现性。组内重现性测定选择三种线性范围内的N蛋白浓度，平行三次测量，计算平均荧光强度、标准偏差(SD)和变异系数(CV)。组间重现性采用三个批次的比色荧光免疫纳米球测定。由表1可见，组内变异系数为4.7%(由三次组内变异系数平均值得到)，组间变异系数为7.5%(由组间变异系数平均值得到)，说明方法具有较好重现性。
表1 方法重现性分析
2.5.4 血清体系检测由图8A和8B所示，T线荧光信号随着血清中N蛋白浓度减少而降低，金纳米粒子颜色也不断变浅。由图8C图可见，在8.9～1.8×102nmol/L范围内，N蛋白浓度与荧光强度呈双对数关系，检测限为3.1 nmol/L。以上结果说明，方法具有较好的抗干扰能力，具有在复杂体系中应用的潜力。
图8 胎牛血清中不同N蛋白浓度时的试纸条荧光图(A)、比色图(B)和荧光检测线性关系(C)Fig.8 Fluorescence images(A) and colorimetric images (B) of testing strips with different concentrations of N protein infetal bovine serum;Logarithmic relationship between fluorescence intensity and concentration of N protein in fetal bovine serum(C)
建立了一种基于比色荧光纳米球的新冠病毒N蛋白免疫层析检测新方法。该方法具有很好的重现性和特异性，抗干扰能力强，在8.9～1.8×102nmol/L范围具有良好线性关系，检测限为2.1 nmol/L。该方法有望用于新冠病毒的快速检测。
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