乔凤昌，程 青，张翠平，许争峰
(南京医科大学附属妇产医院，南京市妇幼保健院，南京 210004)
Joubert综合征是一种罕见的神经系统疾病，临床典型特征为小脑蚓部发育不全或缺如、肌张力减退、眼部运动和呼吸异常、不同程度的智力低下及生长发育迟缓等。影像学磁共振成像为“臼齿状”，即由伸长的小脑上脚和增宽的脚间窝构成[1]。目前已发现35个致病基因，主要遗传方式为常染色体隐性遗传，也有性染色体遗传，具有临床异质性和遗传异质性[2]。因此，临床上对于Joubert综合征的诊断具有一定难度。本研究用外显子测序技术(exome sequencing,ES)对患脑积水的胎儿进行基因测序分析以明确其病因，为家系的遗传咨询、再次妊娠提供依据。
1.1 研究对象 孕妇，27岁，G2P0。孕18周因“产前超声检查提示胎儿脑部发育不良”于2020年12月28日于南京市妇幼保健院就诊。孕妇本次妊娠为自然受孕，于当地医院早期NT检查提示小脑延髓池稍宽，约4mm，胎儿NT<第95th百分位，建议16周复查超声。孕16+2周于当地医院复查超声提示侧脑室宽4mm，小脑延髓池明显增宽，约7mm，双侧小脑半球明显变小，未探及小脑蚓部回声。孕18周本院复查超声提示胎儿颅后窝增宽约1.2cm，小脑蚓部未能清晰显示，小脑半球显示不完整，Dandy-Walker综合征不能排除。孕妇曾于2019年因“孕20周，胎儿脑积水，右足内翻可能”于当地医院引产1次，引产胎儿染色体微阵列检查结果未见异常。否认家族遗传病史，否认近亲婚配。夫妻双方及其他成员均未见异常表型，家系图见图1A。
图1 家系图和Sanger测序验证结果A:家系图；
B:外显子测序技术检测出患儿TMEM216基因c.217C>T(p.R73C)和c.357_359dup(p.I119.dup)的复合杂合突变；
C:Sanger测序验证患儿TMEM216基因的复合杂合突变
经遗传咨询和签署知情同意书后，分别采集胎儿羊水15mL和父母外周血5mL，提取DNA后进行外显子测序检测基因突变情况。本研究获得医院医学伦理委员会批准。
1.2 方法
1.2.1 全外显子测序 采用家系的方式对胎儿及父母进行检测。DNA样本经过超声随机打断为300～600bp大小，采用Agilent SureSelect XT Library Prep Kit建库试剂盒和Agilent SureSelect XT Human All Exon V6 kit捕获试剂盒(Agilent,Santa Clara,CA,USA)对样本进行建库和外显子捕获。富集的捕获区域通过PCR的方法扩增后进行测序(Illumina Hiseq 2500平台，2×150bp读长模式)[3]。
1.2.2 数据分析 去除接头和低质量数据后，使用BWA(Burrows-Wheeler Aligner,v 0.7)软件将测序数据比对到参考基因组序列(GRCh37/hg19),samtool(v 0.1.18)软件去除PCR重复序列后分别使用GATK(v 4.0)和Annovar软件获取位点变异和注释信息。过滤掉最小等位基因频率(GenomAD数据库)>0.5%的位点后，根据软件(Revel,Mutationtaster,Human Splicing Finder等)预测蛋白的功能改变、基因与表型关系(HPO数据库)、遗传方式(OMIM数据库)、家系共分离情况等综合考虑确定候选致病基因和位点。根据ACMG(2015)原则对变异位点进行致病性判断[4]。
1.2.3 Sanger测序 使用NCBI在线软件(Primer-Blast,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=Blast Home)设计用于扩增TMEM216(NM_001173990.3)基因的引物，并由金唯智公司合成。针对c.357_359dup(p.I119.dup)的引物序列：上游5"-TCACATCTCCCACGCCTTTC-3",下游5"-AGAAATGGTCCCTCAGCAGC-3",退火温度60℃,产物大小304bp。针对c.217C>T(p.R73C)的引物序列：上游5"-TTCCCAAGTGTGTGGCAGTT-3",下游5"-GCCCTGACGTGGAGTTACAA-3",退火温度60℃,产物大小487bp。反应条件95℃ 10min;95℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 30s,共35个循环；
72℃ 10min。PCR扩增产物送金唯智公司进行一代测序验证。
2.1 外显子测序结果 患儿外显子测序捕获效率为73.02%，目标区域平均测序深度96.98×，其中测序深度20×以上的区域占目标捕获区域的97.61%，覆盖度良好。数据分析发现在TMEM216基因(NM_001173990.3)上存在复合杂合突变。分别为第3号外显子c.217C>T(p.R73C)的杂合突变，遗传自父亲；
第4号外显子c.357_359dup(p.I119.dup)的杂合突变，遗传自母亲(图1B)。c.217C>T(p.R73C)位点在GnomAD数据库中的人群频率为0.000028(PM2)；
据文献报道，有患者中检出该变异[5-9](PM3_P)；
该变异与致病变异c.218G>T(p.R73L)、c.218G>A(p.R73H)在同一位置有不同的氨基酸改变(PM5_S)；
对之前引产的胎儿留存的DNA进行Sanger测序验证发现前一胎患儿同样遗传此位点(PP1)。根据ACMG(2015)指南，该变异判读为疑似致病变异(PM2+PM3_P+PM5_S+PP1)；
c.357_359dup(p.I119.dup)位点在GnomAD数据库中未收录(PM2)；
反式位置有疑似致病性突变(PM3)；
该变异为非重复区框内插入，导致多肽链的长度发生改变(PM4)；
前一胎患儿同样遗传此位点(PP1)。根据ACMG指南，该变异判读为疑似致病变异(PM2+PM3+PM4+PP1)。OMIM数据库显示该基因的突变会导致Joubert综合征2型。
2.2 Sanger测序验证结果 两个胎儿的TMEM216基因均存在c.217C>T(p.R73C)和c.357_359dup(p.I119.dup)的复合杂合突变，分别遗传自父母，与外显子测序结果一致(图1C)。
Joubert综合征的发病与纤毛结构及功能异常、Shh信号通路相关，临床异质性和遗传异质性较强，涉及35个基因，同一个基因的变异会引起不同表型，不同基因可能导致相同的表型；
根据受累器官的差别分为6种亚型：单纯型、合并眼缺陷型、合并视网膜缺陷型、合并肝脏缺陷型、合并肾缺陷型和伴有口面部畸形[2]。因此，临床上对Joubert综合征进行鉴别诊断相当困难。超声影像学检测具有非特异性和不敏感性，当有表型与其他疾病重叠时则无法做出诊断。胎儿除了明显的结构异常和软指标异常外，其他异常(如生理性的异常)超声检查无法检出，且胎儿期无法表现出疾病应有的表型。考虑到孕妇连续两胎均有类似的症状可能为遗传因素导致，因此采用外显子测序技术为患者寻找致病原因。
通过外显子测序技术对本次胎儿及父母进行检测，发现胎儿TMEM216基因的复合杂合突变，分别遗传自父母，父母决定终止妊娠。TMEM216基因(NM_001173990.3)位于11q12.2，含有5个外显子，编码145个氨基酸，形成的蛋白含有跨膜结构域。Valente等在胎儿组织中首次鉴定，原位杂交结果显示TMEM216在中枢神经系统、肢芽、肾脏和软骨中表达，在小鼠的内髓集尿管细胞、人视网膜色素上皮细胞和近端肾小管上特异性表达，定位于初生纤毛的基部或临近的基体部，是纤毛的组装和功能所必需[5]。目前研究显示，TMEM216基因有127个变异，包含错义突变、剪切位点突变、移码突变、内含子突变等(数据来源于GeneCards数据库:https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=TMEM216&keywords=TMEM216#snp)，但目前尚无产前的病例报道。TMEM216基因突变属于常染色隐性遗传模式，该病例存在复合杂合突变，分别位于c.217C>T(p.R73C)和c.357_359dup(p.I119.dup)。错义突变c.217C>T(p.R73C)和框内插入变异c.357_359dup(p.I119.dup)位于Transmemb_17结构域，变异破坏了蛋白的跨膜功能，前者已有致病性报道[6-9]，后者为新发现的变异位点。根据ACMG原则可对这两个位点做出可疑致病的判断，患儿诊断为Joubert综合征2型患者。Joubert综合征2型除了有脑部典型特征外，还可有肌张力减退、眼球震颤、斜视和肾功能障碍等特点[10]，但因患者为产前的胎儿，因此其他症状无法检出或暂时没有表型。此家系中两个胎儿均遗传了父母携带的杂合突变，父母再生育时需进行植入前产前诊断排除致病位点或自然妊娠，但自然妊娠的胎儿有25%概率仍遗传此复合杂合变异，需妊娠期进行产前诊断。同时提示连续两胎具有类似症状的患儿，其患隐性遗传病的可能性较大。
本研究中夫妻曾有过一次不良孕产史，且染色体芯片结果未见异常，因此对于本次具有类似表型的胎儿直接进行外显子测序，这种策略也符合ISPD最新的声明[11]。已有报道发现连续两次不良生育史的家庭其患儿的遗传学病因是父母的复合杂合突变导致。Wang等[12]对连续两次羊水过多胎儿进行外显子测序检测发现胎儿系LMOD3的c.1412delA(p.Lys471Serfs*18)和c.1283dupC(p.Gly429Trpfs*)变异引起的线状体肌病。Wang等为两个异染性脑白质营养不良患儿寻找到致病性原因是ARSA基因的c.302G>T和c.1344dupC复合杂合变异[13]。同时，Chitty等综合分析了文献报道的4350余例各系统畸形胎儿采用外显子测序后的异常检出情况，发现417例神经系统异常胎儿在核型/染色体芯片检出阴性后进行外显子测序进一步确诊的为17%(12%～22%)[14]。对于产后神经系统异常的患者，神经系统疾病专家组分析了30篇已有报道发现外显子测序的检出率为36%，单纯神经系统异常患者的检出率为31%，合并其他系统异常的检出率高达53%[15]。因此，外显子测序技术为神经系统异常胎儿/患者寻找遗传学病因的一项有效手段。
综上所述，采用外显子测序技术为患有Joubert综合征2型的胎儿提供了遗传学诊断，同时拓展了Joubert综合征的致病基因变异谱，为该综合征的遗传咨询、产前诊断和再次妊娠提供了理论依据，进一步证实了外显子测序技术在产前神经系统发育异常胎儿中应用的可行性及价值。
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