徐秋爽,马琦,张丽丽,王茜莲,张婷婷,迪丽达尔·多力坤,罗晓,安景荣·安治国,徐斌,伊琦忠
抑郁障碍(MDD)是常见的严重精神疾病,全世界有超过3.5亿人受该疾病困扰,已成为世界第4大疾病,并且患病人数还在快速增长中[1]。近年来研究表明由肠道微生物、中枢神经系统、肠神经系统构成的双向沟通途径“微生物-肠-脑”轴,在MDD的发生发展中发挥重要作用,MDD患者肠道菌群构成与健康人群有显著差异[2]。人酪酪肽(PYY)作为肠-脑-轴中的肠道内分泌代谢物,作用于迷走神经上的传入神经元向大脑传送信息,研究报道其受体Y4在大脑中表达,Y4受体敲除与减少焦虑抑郁行为有关[3]。有研究证实伴有肥胖的、饮食失调的MDD患者空腹血浆PYY水平显著高于正常人群[4-5]。而肥胖的人或高脂饮食人群通常有肠道菌群紊乱,肠道菌群组成的改变可通过微生物-肠-脑轴影响认知、诱发焦虑抑郁行为。而益生菌如乳酸杆菌和神经行为紊乱相关的症状[6]相关。因此,本次通过对首发未治疗的MDD患者和健康对照者的肠内乳酸杆菌相对含量和PYY水平及糖脂代谢指标的比较研究,分析探讨中国维吾尔人群MDD发病机制。
1.1 对象
为2020年1月至2021年3月在我院就诊的83例首发维吾尔族抑郁障碍患者和85名同院体检中心的维吾尔族健康对照,包括40例患者外周血样本、40名健康者全血标本及43例患者粪便样本、45名健康者粪便样本。两组在年龄、性别方面均衡可比。见表1。
表1 两组性别、年龄的比较(例数
对照组入组标准:①健康维吾尔族人群,无精神疾病且自愿参与本研究者；
②年龄18～65岁；
③健康问卷(patient health questionnaire-9,PHQ-9)得分≤4分,排除标准:①入组前接受过任何形式精神治疗；
②其他精神疾病史；
③因药物或器质性精神病引起的继发性精神障碍；
④有神经系统疾病史；
⑤有脑结构异常的MRI证据；
⑥采样前1个月内食用任何益生元、益生菌等功能性食品,或服用任何影响菌群组成的抗生素及其他药物；
⑦有重大疾病或内分泌疾病(如心脏病、糖尿病)。所有参与研究者均知情同意,并经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准(批准文号:20201106-08)。
1.2 方法
1.2.1 粪便和血浆PYY浓度测定 采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)法检测血浆和粪便中PYY水平,试剂盒采用人酪酪肽(PYY)酶联免疫吸附测定试剂盒。对于有PYY的包被微孔,依次加入 HRP 标记的捕获抗体、样品、标准品和检测抗体,孵育并彻底清洗。颜色随着 TMB 底物在过氧化物酶催化下变成蓝色而在酸的影响下最终变成黄色。色调与样本中的PYY浓度呈正相关。用酶标仪在 450 nm 波长处测量吸光度(OD 值),计算样品浓度。
实验结果计算：利用 Curve Expert 1.30 软件绘制标准曲线并转换待测样品蛋白浓度。具体为:从标准值和样本值中减去S0孔的值,以标准品S1-S6将其绘制标准曲线。标准浓度值设置的是纵坐标(即对数坐标),OD值设定为横坐标(即对数坐标),然后把标准曲线绘到与其相应的对数坐标纸上,然后再按照样品的OD值,从标准曲线上来标定相应的实际含量。最终计算乘以相应的稀释倍数,即样品的实际浓度。
1.2.2 糖脂代谢指标的测定 病例组及对照组受试者空腹血糖(blood-glucose,Glu)、三酰甘油(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)均采用罗氏全自动生化分析仪检测完成。
1.2.3 粪便DNA提取、乳酸杆菌含量的测定 称取200 mg粪便样本,使用康为粪便DNA提取试剂盒从粪便细菌基因组中分离纯化提取DNA,最后得到粪样中细菌总DNA。按说明书进行操作,提取后迅速置于-20℃环境下保存待用。通过文献查阅[7]及 Pubmed BLAST 比对设计引物,以 16S rDNA 为内参,由通用生物公司合成。采用 QuantiNova-SYBR-Green PCR Kit 试剂盒(Cat.No.208054)通过实时荧光定量PCR仪(QuantStudioTM 6 Flex Real Time PCR System,Applied-System)PCR仪对目标菌及内参基因进行扩增,每样本重复3次。肠道细菌引物序列及退火温度如下:肠道菌群通用引物,16S rDNA:上游引物:TCCTACGGGAGGCAGCAGT,下游引物:GGACTACCAGGGTATCTATCCTGTT,退火温度58℃；
乳酸杆菌:上游引物:TGGAAACAGGTGCTAATACCG,下游引物:GTCCATTGTGGAAGATTCCC,退火温度58℃。根据Ct值2-ΔΔCT法计算乳酸杆菌相对含量。
1.2.4 统计学方法 采用SPSS 26.0统计软件进行数据处理。计量资料采用均值±标准差表示,组间比较用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。采用Pearson相关性分析讨论PYY与肠内乳酸杆菌、抑郁程度及糖脂代谢指标等的相关性。
2.1 两组肠内乳酸杆菌含量的比较
经qRT-PCR检测,病例组肠内乳酸杆菌含量(5.64±1.23)低于对照组(15.43±3.14),差异有统计学意义(t=-2.85,P<0.05)。
2.2 血浆、粪便PYY在组间的分布
病例组血浆PYY水平高于对照组，差异具有统计学意义(t=2.18,P<0.05)；
病例组粪便PYY水平为高于对照组，差异具有统计学意义(t=2.18,P<0.05)。见表2。
表2 两组PYY水平比较
2.3 病例组与对照组糖脂代谢指标的比较
病例组血清GLU、TC、HDL、LDL水平均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。两组TG水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
表3 两组糖脂代谢指标比较
多项研究表明抑郁障碍可能是多基因复杂遗传性疾病,肠道菌群的改变可能是导致抑郁障碍的重要原因[2]。既往研究[7-8]显示,与健康人群相比,MDD患者肠道微生物多样性和丰度均明显下降,本研究发现中国维吾尔MDD患者肠道乳酸杆菌含量下降,与既往研究结果一致。乳酸杆菌是一种对人体健康具有重要作用的益生菌,能促进人体叶酸合成、减少肠内同型半胱氨酸含量,而同型半胱氨酸与抑郁障碍的发病存在着关联[9]。动物实验证明抗抑郁药物联合补充益生菌疗效优于单用抗抑郁药[10-11],并有临床研究[12-13]显示,乳酸杆菌增加量与HAMD减分率呈正相关,补充乳酸杆菌能有效降低Beck量表评分。Yun等[14]研究发现乳酸杆菌能通过调节肠道菌群、激活核因子κB,抑制白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达,从而缓解应激诱导的结肠炎、抑郁和认知障碍。本研究为乳酸杆菌与MDD关系提供了证据,并为联合益生菌治疗MDD提供思路。
PYY是肠道L细胞分泌的胃肠激素,是一种对多种组织有抑制功能的胃肠激素,其受体分布于人体多种组织,包括胃肠组织、胰腺、下丘脑弓状核、视前和背内核、杏仁核内侧核、黑质等[4],通过下丘脑影响进食,参与消化协调、饥饿和饱腹信号传递以及能量稳态的调节,也参与情绪的控制和情绪的调节[15],并通过作用于边缘系统和大脑皮质调节感知、情绪等过程[4]。研究发现,在小鼠内侧前额叶皮质注射PYY可改善脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的抑郁样行为[16]。LPS是细菌细胞壁主要成分,能刺激细胞因子的形成,可引起抑郁样行为。本研究中MDD患者空腹血浆及粪便中PYY水平均高于对照组。由此可见PYY作为肠-脑-轴双向通道的中间介质,与抑郁障碍有密切联系,但目前研究结果还不足以解释其中因果关系,需更多研究加以阐明。
本研究中MDD患者存在糖脂代谢异常,病例组血浆GLU、TC、HDL、LDL水平均低于对照组。现阶段多项研究证实抑郁障碍与血脂异常之间存在一定关联,但在不同年龄、不同类型的MDD中表现出的血脂紊乱并不一致[17]。Wei等[18]分析了11项有关TG、HDL、TC、LDL水平的病例对照研究,结果发现TG升高,HDL降低,其余指标无显著差异,而在Bharti等[19]的研究中发现HDL与MDD没有关联。影响糖脂代谢的因素很多,包括遗传和环境、饮食结构、生活方式等。有人认为肠道菌群失衡,短链脂肪酸生成减少,可能是影响正常糖脂代谢的因素之一[20-21]。MDD患者糖脂代谢异常的原因和机制及其在疾病发生发展中的作用尚待进一步研究。胆固醇是类固醇相关激素合成的重要来源,与大脑发育和神经系统疾病密切相关,TC、HDL、LDL水平降低可能会导致中枢5-羟色胺合成不足,使其功能减退,进而导致抑郁症状的发生[22]。糖脂代谢异常与肠内乳酸杆菌的相关性尚不能描述其间的因果关系,还待进一步更深入的机制研究。其次,PYY被证实与代谢综合征相关[23],通过抑制食欲、胰液分泌、减缓胃肠蠕动等多方面调节体内能量代谢[24-25]。因此通过纠正MDD患者肠道微生态、降低PYY水平可以对糖脂代谢稳态的维持起到积极作用。
饮食是对肠道微生物构成最重要的影响因素[26]。地中海式饮食模式下拟杆菌丰度升高、变形杆菌丰度降低[27],而西方饮食模式下拟杆菌丰度下降[28]。为控制不同人群之间饮食习惯、模式不同造成的误差,因此本研究以中国维吾尔人群为研究对象。中国新疆日照时间长、昼夜温差大造成谷物中蛋白质含量和水果中糖分增多,加之日常碳水化合物、脂肪和发酵乳制品摄入较多,维吾尔族人群肠道菌群构成具有其特殊性[29],这些独特的自然条件形成了当地人群日常生活中比较容易获得提高肠道乳酸杆菌丰度的乳制品,这或许对MDD及糖脂代谢等慢性疾病的治疗、康复和管理具有一定的帮助。
本研究不足之处是血液和粪便样本不是来自同一个受试者,只能分别分析血浆、粪便中PYY水平与对照组之间的差异性,而不能确立血浆与粪便中PYY相关性。其次，临床资料收集不全面,缺少了BMI、病程时间、受教育程度等有关影响肠道微生物菌群的混杂因素,使得肠内乳酸杆菌与肠内PYY、糖脂代谢指标的相关性分析不够全面与深入。综上,本研究发现中国维吾尔人群首发抑郁障碍患者肠内乳酸杆菌属含量下降、PYY升高；
维吾尔首发抑郁障碍患者存在糖脂质代谢紊乱,为抑郁障碍发病机制提供一定支持。