宋文龙，葛 卉，刘兴菊，梁海永,2
(1.河北农业大学 林学院，河北 保定 071000；
2.河北省种质资源与森林保护重点实验室，河北 保定 071000)
多倍体植物普遍存在于植物界尤其是被子植物中，多倍化的发生有利于植物进化，其在物种遗传多样性和适应性等方面有着显著优势。多倍体由于基因加倍，导致植物在形态特征、生理特征、遗传适应及抗逆能力等方面发生很大变化［1］。例如，四倍体葡萄较二倍体出现巨大性的特点，叶绿素相对含量、POD 和CAT 活性均提高，抗逆性和适应性增强［2］；
新品种四倍体紫薇‘紫馨’和‘银蝶’较二倍体紫薇叶片、花径、果径都显著增大，抗病抗旱能力增强［3］；
四倍体余蜜桔叶片中与抗旱性相关的激素ABA 含量，与抵抗病原菌侵染密切相关的激素JA 含量等均显著高于二倍体［4］。可见许多植物加倍后的性状优于二倍体，并已广泛应用于生产实践。
转录组测序是一种高通量测序技术，对基因序列依赖性不强，对于无标准基因组的生物体也可以进行无参转录组测序。近年来，转录组测序广泛应用于差异基因表达研究，已在茶树［5］、松树［6］、无油樟［7］等林木中成功应用，为研究植物基因功能提供大量的转录本信息，成为植物基因挖掘的重要手段。
金叶榆(Ulmus pumilacv.‘Jinye’) 是榆科（Ulmaceae），榆属（Ulmus）落叶乔木或灌木，是近年来推广的彩叶绿化植物。其叶片金黄、自然光泽新鲜，耐修剪，易造型，广泛用于绿化，耐寒、耐旱、耐盐碱等优势突出。近年来，对金叶榆的研究主要集中在造型设计［8］、绿化应用［9］及病虫害防治等，对金叶榆多倍体育种研究还未见报道。本研究通过0.1%秋水仙素处理主干伤口，诱导出四倍体金叶榆，并对金叶榆二倍体及其同源四倍体进行生理特征与转录组差异进行分析，探究金叶榆多倍化对生理特征和分子水平影响，以期通过转录组测序获得与倍性相关基因序列，为揭示金叶榆倍性机制提供参考，同时为金叶榆基因工程育种提供分子基础。
1.1 试验材料
供试材料为金叶榆二倍体及其同源四倍体，四倍体由秋水仙素诱变得到，来自河北农业大学西校区林学实验苗圃。供试株系的倍性均通过流式细胞仪进行鉴定。
1.2 生理指标测定
采用YSL-4T 叶绿素测定仪随机挑选二倍体及其同源四倍体3 株，测定叶片的叶绿素相对含量，重复3 次；
同时分别随机选取3 株，采集叶片，重复3 次，取样后迅速放入液氮中保存中暂存，之后转入-80 ℃冰箱保存，用于可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛、超氧化物歧化酶和过氧化物酶测定。
可溶性糖含量采用蒽酮比色法；
可溶性白含量采用考马斯亮蓝G-250 法；
丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法测定；
超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定采用氮蓝四唑光还原法；
过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法。
1.3 无参转录组测序
随机挑选3 株二倍体及其同源四倍体，选取枝条上顶端相同部位的幼嫩叶片，放入锡箔纸中，并迅速放入液氮中暂存。用干冰送至百迈克生物信息公司进行转录组测序。
1.4 数据处理
运用Excel 和SPSS.24 软件对测定各指标进行分析，运用独立样本t检验法分析二倍体和同源四倍体金叶榆各指标之间差异性显著；
转录组数据及生物信息学分析在百迈克云平台进行。
2.1 金叶榆多倍体株系的倍性鉴定
以金叶榆二倍体为对照，流式细胞仪测得其染色体荧光强度值为190 ～200，表现出较高单峰。将秋水仙素处理的金叶榆，通过流式细胞仪测得染色体的荧光强度值为380 ～400，处理后金叶榆染色体荧光强度约为二倍体的2 倍，鉴定为同源四倍体（图1）。
图1 金叶榆二倍体（A)及其同源四倍体(B)叶片细胞的DNA 荧光强度分布Fig.1 Fluorescence intensity distribution of DNA in leaf cells of the diploid (A) and its induced autotetraploid(B) of Ulmus pumila cv.‘Jinye’
2.2 金叶榆二倍体及其同源四倍体的生理指标
叶绿素是植物进行光合作用的重要色素因子，其含量高低反应植物光合能力的强弱。植物体内的可溶性糖和可溶性蛋白是植物的主要代谢物，MDA、SOD 及POD 是植物体内抗逆性相关的活性酶［10］，与植物的生长和抗逆性有直接关系，因此常用来评价植物抗逆性。金叶榆染色体加倍后，这些指标发生了变化，其对逆境的适应和抵抗可能会发生相应的变化。由表1 可见，四倍体金叶榆叶片中的叶绿素相对含量、可溶性糖和可溶性蛋白比二倍体植株分别增加8.20%、38.63%和52.79%，MDA含量比二倍体降低37.23%，同时SOD 活性和POD活性比二倍体植株分别增加95.48%和46.45%，说明四倍体金叶榆代谢能力和清除体内的过氧化物的能力提高，增强环境适应能力，抗逆性增强。
表1 金叶榆二倍体及其同源四倍体不同生理指标对比Table 1 Comparison of different physiological indices of diploid and its autotetraploid of Ulmus pumila cv.‘Jinye’
2.3 金叶榆二倍体及其同源四倍体的转录组测序结果
对样品进行转录组测序，共获得37.96 Gb Clean Data，各样品Clean Data 均达到5.86 Gb，Q30 碱基百分比在95.56%及以上，GC 含量均45.56%以上，组装后共获得34 424 条Unigene，组装完整性较高，可用于后续分析。
2.4 金叶榆二倍体及其同源四倍体的差异表达基因
对金叶榆二倍体及其同源四倍体进行Unigene的差异基因分析，结果如图2 所示，共有1 283 个差异表达基因，其中上调表达基因数为1 078 个，下调表达基因数为205 个，上调表达基因数显著高于其下调基因数。
图2 差异表达基因火山图Fig.2 Volcano map of the difference genes
2.5 差异表达基因GO 功能分析
为了对比金叶榆二倍体及其同源四倍体之间差异表达基因的生物学功能，进行GO 功能富集。由图3 可知，有995 个差异表达基因被GO 注释到生物过程、细胞组分以及分子功能3 大类别。生物过程中注释了18 种功能，主要功能有代谢过程、细胞过程和单体功能；
在细胞组分中注释了15 种功能，主要功能有细胞、细胞部分、细胞膜和细胞膜部分；
在分子功能中注释了12 中功能，主要功能有催化活性、结合和转运蛋白活性。可见其功能均与细胞代谢活动和生长发育等方面有关。
图3 差异表达基因GO 注释分类统计图Fig.3 Differentially expressed genes GO annotation classification statistics graph
2.6 差异表达基因COG 注释
将差异表达基因进行COG 注释，注释结果如图4。有384 条差异表达基因得到注释，主要注释在碳水化合物的运输和代谢、次生代谢产物合成、细胞壁、膜生物合成、翻译、核糖体结构和生物合成、脂质运输和代谢、氨基酸运输和代谢等。这些代谢产物和生理过程与植物生长发育密切相关，与四倍体植株叶面积增大，光合速率提高，呼吸速率增强等有密切联系。
图4 差异表达基因COG 注释分类统计图Fig.4 Differentially expressed genes COG annotation classification statistics graph
2.7 差异表达基因KEGG 分析
对金叶榆二倍体及其同源四倍体差异表达基因KEGG 的注释结果按照KEGG 中通路类型进行分类（图5），分为细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、代谢机制和组织系统五大类特定的KEGG通路中。其中，代谢机制中差异表达基因被注释到的数目最多，主要为淀粉和蔗糖代谢、苯丙烷生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、碳代谢、类黄酮生物合成、氨基酸生物合成以及糖酵解等37 个亚类。另外，在胞吞作用、植物激素信号传导、核糖体及植物病原体互作等通路中也注释到较多差异表达基因。将差异表达基因进行KEGG 通路富集分析，共有11 条代谢通路显著富集（P＜0.05）（表2）。其中植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢、苯丙烷类生物合成和戊糖和葡萄糖醛酸盐的相互转化等代谢通路差异表达基因的数目较多。植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢和二萜类生物合成等通路的差异基因显著性最为明显。说明四倍体中与代谢相关基因显著上调，与植物激素信号转导通路有密切联系。
表 2 差异表达基因的KEGG 通路富集分析Table 2 Analysis of KEGG pathway enrichment of DEG
图5 差异表达基因KEGG 分类图Fig.5 Classification map of differentially expressed gene KEGG
2.8 植物激素信号转导通路分析
差异表达基因通过KEGG 通路富集，共得到99个KEGG 通路，其中植物激素信号转导通路富集水平最显著。本研究中，有46 个差异表达基因显著富集在植物激素信号传导通路中。其中41 个在四倍体中表达量较高，其中以生长素（Auxin,IAA）、油菜素内酯（Brassinosteroid）和水杨酸（Salicylicacid）信号转导途径富集基因数最多（图5）。在生长素信号转导中与生长素抑制因子和生长素响应因子相关的基因上调表达；
油菜素内酯信号转导中与TCH4和CYCD3相关基因上调表达；
在水杨酸信号转导中与NPR1 和PR-1 相关基因得到上调表达。差异基因的上调表达直接影响内源激素水平，内源激素水平变化显著影响细胞生长、代谢与酶活等生理过程，对四倍体金叶榆叶片面积，叶片厚度，叶片颜色等产生影响。
图5 相关激素信号转导通路Fig.5 Related hormone signaling pathways
3.1 金叶榆二倍体及其同源四倍体部分生理指标比较
植物染色体加倍后会影响生理生化特征变化，主要表现在光合色素含量、生物酶活性和次级代谢产物等方面。四倍体植株普遍比二倍体植株具有更高活性成分含量，因此四倍体抗逆性更强［11］，染色体加倍育种是增加植物产量和提高抗逆性的重要手段之一。本研究中发现四倍体金叶榆中叶绿素相对含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、SOD 活性和POD 活性均显著高于二倍体金叶榆，MDA 含量则显著低于二倍体金叶榆，这与酸枣［12］和刺槐［13］染色体加倍后表现相同。叶绿素含量的提高导致绿色叶片加深，可溶性糖及可溶性蛋白含量提高使植株有更多能源物质，从而导致四倍体金叶榆叶片变大变厚，生长速度加快。SOD 和POD 活性提高及MDA 含量降低，提高四倍体金叶榆的抗氧化能力和抗逆能力。
3.2 二倍体与四倍体差异基因分析
植物染色体加倍后，基因表达发生变化从而引起表型和生理变异。近年来，转录组测序技术已广泛应用于多倍体植株与二倍体植株差异基因表达分析，如茅苍术［14］、西瓜［15］、霍山石斛［16］和刺槐［13］。本研究对金叶榆二倍体及其同源四倍体叶片进行无参转录组测序，测序数据组装完整性较高。因此，对金叶榆二倍体及其同源四倍体的差异表达基因进行分析，共有1 283 个差异表达基因，其中1 078 个表达上调，205 个表达下调。差异表达基因通过GO富集分析，发现主要富集在代谢过程、细胞过程、细胞、催化活性、结合和转运蛋白活性等，说明四倍体金叶榆在生长发育和抗逆方面与二倍体存在差异；
COG 注释结果显示，主要注释在碳水化合物的运输和代谢、次生代谢产物合成、膜生物合成、脂质运输和代谢和氨基酸运输和代谢等；
KEGG 富集结果显示，植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢和二萜类生物合成等通路的差异基因显著性最为明显。说明在四倍体中上调表达的差异基因可能参与植物内源激素、可溶性糖和可溶性蛋白的积累过程，为植株生长提供更多能量，从而提高四倍体金叶榆生长势。四倍体金叶榆叶片变大变厚，茎加粗，绿叶颜色加深等特征可能与差异基因表达有关。
3.3 差异基因功能分析
植物生长发育与内源激素调节密不可分，细胞分化、糖类物质合成和酶活等生理过程受内源激素水平影响［17］。油菜素内酯具有促进植物生长发育及提高植物抗氧化酶类的生物活性的作用，提高植物抗逆性［18］。水杨酸［19］是重要的免疫激素，通过诱导抗病基因的表达来提高植物抗病能力。酸枣四倍体与二倍体的差异基因参与了内源生长素的合成及传导过程，使四倍体酸枣表型发生变异［20］。本研究中，KEGG 通路中植物激素信号转导通路富集最显著，其中生长素、油菜素内酯和水杨酸信号转导途径富集基因数最多，在四倍体金叶榆生长素信号转导途径中，生长素响应因子和生长素流入载体受差异表达基因上调表达；
油菜素内酯信号转导途径中细胞周期蛋白和糖基转移酶受到上调表达；
水杨酸信号转导途径中调节蛋白和病原体相关蛋白受到上调差异表达基因的调控。
本研究以金叶榆二倍体及其同源四倍体叶片转录组测序与生理特征相结合进行基因表达变化分析，发现二者在生理特征、生长发育以及抗逆能力等方面存在差异，以上结果可进一步为金叶榆关键调控基因的定位及基因工程育种提供分子基础。
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