李晓宇，冯丽娟，徐 乐，王丽丽，张美霞，李淑英，李纪彬，徐永平
( 1.大连理工大学 生物工程学院，辽宁 大连 116024；
2.动物性食品安全保障技术教育部工程研究中心，辽宁 大连116600；
3.辽宁省噬菌体应用专业技术创新中心，辽宁 大连 116600；
4.大连赛姆生物工程技术有限公司，辽宁 大连 116600 )
仿刺参(Apostichopusjaponicus)，因其富含胶原、黏多糖、生物活性肽等生物活性物质，具有增强机体免疫能力、抗氧化、抗肿瘤、降血压、抗炎症、抗凝血等生理功效，在开发新食品和生物医药等领域显示出巨大潜力，已经成为全球范围内备受青睐的减少疾病发生和促进人体健康的食物之一[1]。目前，我国仿刺参年产量约20万t，直接经济效益高达300亿元，全产业链超过1000亿元，形成了以“辽参”、“胶东刺参”、“南方刺参”为特色的辽宁、山东、福建三大仿刺参产区[2]。
但仿刺参养殖的快速扩张和集约化导致了各种病害频繁发生，造成了巨大经济损失，已成为该行业可持续发展的限制因素之一。其中，刺参腐皮综合征自2003年于山东荣成市首次被报道以来，因其急性发病、高传染性及死亡率的特点，被认为是最常见和最严重的仿刺参疾病，引起了国内外学者的高度关注[3]。大量研究表明，该病发病机理较复杂，是由多种因素的综合作用所致，主要包括细菌、真菌和寄生虫，其中细菌是最主要的病原体，寄生虫和真菌次之[4]。发病初期一般以细菌感染为主，继发产生霉菌、寄生虫感染从而加剧仿刺参的死亡。此外，导致发病的致病菌存在多样性和地域性特点[5]。在辽宁地区，可能的细菌病原有灿烂弧菌(Vibriosplendidus)、黄海希瓦氏菌(Shewanellamarisflavi)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonasnigrifaciens)以及蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)等；
在山东地区，灿烂弧菌、溶藻弧菌、中间气单胞菌(Aeromonasmedia)以及假交替单胞菌等均已被证实是致病菌；
南方地区主要集中在灿烂弧菌、假交替单胞菌以及塔式弧菌(V.tubiashii)等[6-7]。2019年3月，大连地区某刺参养殖场仿刺参出现摇头、排脏、体壁大面积溃疡等病害症状。为明确该病症出现的原因，笔者自患病仿刺参病灶处分离病原菌并鉴定，对其致病性、毒力基因及药物敏感性进行分析，以期为大连地区仿刺参细菌性疾病的研究及防控提供一定的病原学依据。
1.1 试验材料
患病仿刺参及回接感染试验所用健康仿刺参均由辽宁大连普兰店某刺参养殖场提供，健康仿刺参在实验室环境下砂滤海水中暂养14 d。溶解氧≥5 mg/L，温度(16±1) ℃，盐度30～32，pH 8.0±0.3，每日按体质量的3%投喂饵料1次，次日吸底排污。
2216E琼脂培养基、硫代硫酸盐—柠檬酸盐—胆盐—蔗糖(TCBS)琼脂培养基购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；
药敏纸片购于杭州微生物试剂有限公司；
细菌基因组DNA提取试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；
PCR扩增所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，PCR扩增所用其他试剂均购于该公司。
1.2 方法
1.2.1 病原菌的分离纯化及形态学观察
将有明显溃疡症状的仿刺参体壁、沙嘴等部位于无菌条件下通过棉棒蘸取或匀浆处理，磷酸缓冲盐溶液(PBS)梯度稀释后划线或涂布接种至TCBS琼脂培养基和2216E琼脂培养基上，28 ℃连续培养12～24 h。经多次分离纯化获得单一菌株(编号为AP-1)，观察其在不同培养基上的菌落特征。同时，采用透射电子显微镜(JEM-2000EX)于加速电压120 kV条件下观察负染色后的细菌形态特征。
1.2.2 人工回接感染试验
选取体质量(12±1) g的健康仿刺参随机分组，每组20头。整个试验期间除不投饵料外，其他条件均不变。将病原菌经活化、扩大培养及离心后的菌泥用磷酸缓冲盐溶液进行重悬，通过平板涂布法计算菌悬液中菌落数目，之后将菌悬液梯度稀释至105～109数量级(cfu/mL)，于4 ℃备用。人工回接感染试验采用以下3种攻毒方式进行：
腹腔注射攻毒：试验组腹腔注射密度分别为109、108、107、106数量级和105数量级的菌悬液(cfu/mL)，每头100 μL；
对照组注射等体积的无菌磷酸缓冲盐溶液。
体壁创伤浸浴攻毒：用锋利的无菌刀片在每头仿刺参体壁上分别划1～2个长0.2～0.3 cm、深0.1 cm的伤口。试验组将水箱中海水菌液终密度(cfu/mL)分别调至109、108、107、106和105数量级，共5组；
对照组为等体积海水。
浸浴攻毒：不对仿刺参造成任何损伤，其他条件同上，不做任何改动。
攻毒结束后，记录10 d内各组仿刺参生存状态及发病率，通过Prism Graphpad 5.0软件分析绘制仿刺参的生存曲线并通过改良寇氏法计算半数致死剂量(LD50)及半数致死密度(LC50)。同时，再次进行细菌的分离以验证是否为同株致病菌，并取患病仿刺参溃疡体壁组织制备石蜡切片，通过苏木精—伊红染色，观察仿刺参体壁组织的病理学变化。
1.2.3 16S rDNA及生理生化鉴定
根据细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取菌株AP-1基因组DNA即PCR扩增模板。PCR反应体系(25 μL)：上、下游引物(27F:5′-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3′；
1492R:5′-TACGG CTACCTTGTTACGACTT-3′)各1 μL，DNA模板1 μL，预混液12.5 μL，双蒸水9.5 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；
94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；
72 ℃终延伸10 min。扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA测序。将测序结果在美国国家生物技术信息数据库中进行BLAST比对，选择与分离株同源性较高的DNA序列，通过MEGA 10.0软件采用邻位归并法构建系统发育树。
通过VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定分析系统(法国生物梅里埃公司)对菌株AP-1进行生理生化指标的检测。
1.2.4 致病菌毒力相关基因检测
对分离菌株的毒素表达调控蛋白(toxR)基因、鞭毛蛋白(FlaA)基因、胶原蛋白酶(Collagenase)基因、外膜蛋白(ompW)基因、铁摄取调节(fur)基因、碱性丝氨酸蛋白酶(AspA)基因、溶血素(tlh)基因等7种毒力相关基因进行PCR扩增，引物设计参考魏霜等[8-9]相关研究(表1)。PCR反应体系同上。扩增程序：94 ℃预变性5 min；
94 ℃变性30 s，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，30个循环；
72 ℃终延伸10 min。对PCR扩增结果进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
表1 PCR扩增所用引物序列及扩增产物长度Tab.1 Primer sequence and length of PCR products
1.2.5 药敏分析
选用不同类型的27种抗生素药敏片对分离株进行药物敏感性检测，具体操作及判定参考美国临床实验室标准化协会(CLSI)的执行标准[10-11]。
2.1 病原菌的分离及形态观察
取样患病仿刺参的症状表现为摄食量明显减少，附壁能力减弱，排脏，且有明显的溃烂(图1)。经分离纯化后，优势菌株AP-1在TCBS琼脂培养基上呈现亮黄色，大小中等，圆形隆起、表面光滑、边缘整齐，略黏稠且不易被挑起，周边呈淡黄色环形光晕(图2a)。此外，改变培养基的琼脂密度，菌落形态会发生一定变化。在琼脂密度为1.5%的2216E固体培养基上不易形成单菌落，黏稠，边缘不清晰，呈弥散状态(图2b)；
当琼脂比例增至5%后，与在TCBS琼脂培养基上形态一致，但菌落四周有明显的透明样晕圈(图2c)。
图2 优势菌株AP-1在不同培养基上的菌落形态Fig.2 Colony morphology of dominant strain AP-1 on different mediaa.TCBS培养基；
b.琼脂密度为1.5%的2216E培养基；
c.琼脂密度为5%的2216E培养基.a.TCBS medium;b.2216E medium with 1.5% agar density;c.2216E medium with 5% agar density.
经负染色后，透射电子显微镜下观察到菌株AP-1呈棒状，大小约为1.4 μm，具有极生单鞭毛，两端钝圆(图3)。
图3 优势菌株AP-1透射电镜图(负染色)Fig.3 Transmission electron micrograph of dominant strain AP-1 (negative staining)
2.2 人工回接感染试验
人工回接感染试验结果表明：浸浴攻毒仿刺参全部存活且未出现病变症状；
腹腔注射和体壁创伤浸浴感染2种攻毒方式的仿刺参出现致死现象，且呈现剂量依赖性死亡特征，即密度越高死亡率越高(图4)。在腹腔注射攻毒试验中，中高剂量组(>9.75×105cfu/g)仿刺参全部死亡，应用改良寇氏法，通过数据计算得出半致死剂量为3.08×104cfu/g；
在体壁创伤浸浴攻毒试验中，第2天便有仿刺参死亡，菌液密度为1.17×108～1.17×109cfu/mL时死亡率达100%，且半致死密度为5.23×106cfu/mL。
图4 菌株AP-1攻毒后的仿刺参累积死亡率Fig.4 Cumulative mortality of sea cucumber A. japonicus exposed to challenged with strain AP-1a.腹腔注射攻毒；
b.体壁创伤浸浴攻毒.a.intraperitoneal injection infection;b.body wall wound immersion infection.
攻毒期间，仿刺参患病初期时有明显的摇头行为，排脏吐肠，附着力下降，体壁出现针尖状白点；
中期症状为仿刺参均沉于底部，不能贴壁，出现大量的溃疡斑点；
末期仿刺参死亡，自溶为鼻涕状胶体，其症状与自然发病相同(图5)。观察仿刺参体壁的石蜡切片可以看到，与正常体壁相比，患病组织存在明显的组织病理学变化，其表皮的角质层明显缺失且不连续，结缔组织不再紧密有序，出现大量空洞和纤维样病变(图6)。
图5 人工回接感染后患有腐皮综合征的仿刺参症状Fig.5 Symptom of sea cucumber A. japonicus with skin ulceration syndrome exposed to challengeda.初期；
b.中期；
c.末期.a.initial stage;b.intermediate stage;c.final stage.
图6 人工回接感染患刺参腐皮综合征的体壁病理变化Fig.6 Pathological changes in the body wall of sea cucumber A. japonicas with skin ulceration syndrome caused by artificial reinfectiona.正常；
b.患病；
C.角质层；
EP.上皮细胞；
CT.结缔组织；
箭头为组织病变.a.normal;b.diseased;C.cuticle;EP.epithelial cell;CT.connective tissue;arrow shows tissue lesions.
2.3 16S rDNA及生理生化鉴定
2.3.1 分离株16S rDNA鉴定及系统发育树的构建
经测序，菌株AP-1扩增得到的16S rDNA片段长度为1470 bp，并与美国国家生物技术信息中心数据库中的相关序列进行BLAST比对，菌株AP-1系弧菌属，与溶藻弧菌同源性高达99%。选择与其同源性较高的序列进行系统发育树构建，结果显示，菌株AP-1与溶藻弧菌ATCC 17749(GenBank登录号：NR_117895.1)和NBRC 15630(GenBank登录号：NR_113781.1)聚为一支(图7)。
图7 基于16S rDNA构建的系统发育树Fig.7 Phylogenetic tree based on 16S rDNA
2.3.2 致病菌的生理生化鉴定
通过GN鉴定卡分析比对可知，该菌株被鉴定为溶藻弧菌的可信度为97%(表2)。结合16S rDNA鉴定结果，进一步确定菌株AP-1为溶藻弧菌。同时，对回接感染后分离菌株再次验证，结果表明为同一株菌。
表2 菌株AP-1的生理生化鉴定结果Tab.2 Physiological and biochemical identification results of strain AP-1
2.4 致病菌毒力相关基因检测
通过对目的片段的PCR扩增产物进行电泳检测得出，菌株AP-1携带有toxR、FlaA、Collagenase、fur、AspA、ompW和tlh共7种毒力相关基因(图8)。
图8 菌株AP-1毒力相关基因的PCR检测Fig.8 PCR detection of virulence related genes of strain AP-1M.Marker;1.toxR;2.FlaA;3.Collagenase;4.fur;5.AspA;6.ompW;7.tlh.
2.5 药敏试验结果
对临床和水产常用的27种抗生素敏感性的检测结果(表3)表明：溶藻弧菌AP-1对氨苄西林、哌拉西林、奥格门汀、头孢唑林、头孢噻肟及阿米卡星6种抗生素耐药；
对头孢呋辛、头孢西丁、氯霉素、氨曲南和新霉素5种抗生素表现为中介；
对其他16种受试抗生素均敏感。
表3 AP-1菌株药物敏感性试验结果Tab.3 Antibiotic susceptibility of the strain AP-1
3.1 病原菌的分离鉴定及致病性
目前，细菌性疾病是报道最多的仿刺参疾病，也是实际养殖生产过程中危害最严重的疾病[12]。笔者从患病仿刺参病灶处分离获得1株优势菌株AP-1，人工回接感染后与自然发病症状一致，再次对病灶处进行致病菌的分离鉴定，结果显示为同一株溶藻弧菌，证实其为刺参腐皮综合征的致病菌，符合科赫法则的验证方法。
溶藻弧菌是世界范围内河口及沿海海洋生态系统中普遍存在的条件致病菌，可感染海洋环境中的多种宿主，包括鱼类、甲壳类和贝类等动物，限制了水产养殖业的发展[13]。此外，也可能导致人患中耳炎、败血症及其他肠外感染等多种疾病，是沿海地区突发食物中毒及腹泻感染的主要致病菌之一，且具有较高的水产品致病菌检出率，对食品及公共卫生安全构成较大威胁[14]。笔者通过平板划线观察细菌形态特征发现，在琼脂密度为1.5%的2216E琼脂培养基上不易形成单菌落，而将琼脂密度提高至5%，可形成单菌落，且菌落四周有明显晕圈，取细菌外周的物质平板划线，也可以得到相似的结果(文中未显示)。导致这种现象的原因可能是溶藻弧菌生长速度快，在固体培养基中可形成周生鞭毛，具有涌动能力[15]，使其菌落极易成片，而提高琼脂密度可以使培养基硬度增加，会限制其在固体表面的涌动现象，使其不易获取营养成分，从而形成单菌落。
人工回接感染试验结果显示，在攻毒方式上仿刺参浸浴感染不能出现病变症状且全部存活，而腹腔注射和体壁创伤浸浴感染2种攻毒方式出现明显的死亡迹象且呈现剂量依赖性。浸浴感染未能造成异常的原因：一方面可能是仿刺参处于健康状态时不易发病，其体腔细胞和体壁组织中存在免疫功能细胞，为抵御外来病原体的侵袭提供了机体免疫的屏障；
另一方面说明溶藻弧菌对仿刺参的致病机理可能是需要在仿刺参损伤部位吸附并大量增殖，通过外、内毒素等致病因子对仿刺参体壁造成损伤，由表及里，触发仿刺参自溶机制致其死亡，与已有文献[6,16-18]的观点一致。本试验结果与杨嘉龙等[19]分离的溶藻弧菌(体壁肌肉攻毒半数致死量LD50为5.68×106cfu/头)结果相比有所不同，其腹腔注射攻毒并无仿刺参死亡，可能与其致病力低有关。目前，辽宁地区90%的仿刺参养殖均采用池塘养殖[20]，在养殖过程中经常需要“倒池”来保证适宜的密度和良好的生长环境，但这具有很高的破坏性，通常会对仿刺参体壁组织造成严重的机械损伤[21]，而且1—3月水温低，仿刺参处于休眠或半休眠状态，群体抵抗力下降，加之底质恶化等问题会导致溶藻弧菌等病原菌激增，势必会造成仿刺参细菌性疾病的大规模暴发。因此在仿刺参养殖过程中要注意水质及养殖密度，防止因操作不当导致仿刺参机体损伤，使得病原菌侵入致病害发生。
3.2 分离株的毒力基因分析
据报道，溶藻弧菌的毒力因子主要包括黏附因子(外膜蛋白、鞭毛)、胞外产物(溶血素、碱性丝氨酸蛋白酶和胶原蛋白酶等)和铁摄取系统等[22]。张晶等[23]发现，不同来源溶藻弧菌所携带毒力因子的种类不同，其致病因子存在复杂性及独特性。本试验结果显示，toxR、FlaA、Collagenase、fur、AspA、ompW和tlh 7种毒力相关基因均有明显条带，表明溶藻弧菌AP-1携带多种毒力因子，这可能是其致病力较强的主要原因。已有报道指出，外膜蛋白(ompW)在细菌黏附及摄铁过程中发挥重要作用[24]，FlaA是鞭毛蛋白合成所必需，在溶藻弧菌黏附宿主过程中起重要作用[25]，可能为溶藻弧菌黏附于仿刺参体壁或其他部位进而侵袭提供了条件。有研究表明，胶原蛋白酶(AspA)及碱性丝氨酸蛋白酶(Collagenase)的表达量与毒力大小具有相关性[8]，而仿刺参体壁主要由胶原等蛋白质组成，这2种蛋白酶的存在可能与仿刺参组织发生降解从而溃疡相关。铁摄取调控(fur)是病原菌自身获得铁元素、发挥毒性的必要条件，toxR是一种重要的毒力调控基因，影响胞外蛋白酶的分泌及生物膜的形成[26]。溶血素是与靶细胞膜上的受体结合的成孔毒素，在蛋白质水解激活后，诱导孔或通道形成，从而破坏膜通透性、渗透裂解，最终导致细胞死亡[27-28]。在该毒素存在的情况下，可能会导致仿刺参体壁组织的细胞死亡。在本试验中，溶藻弧菌AP-1导致仿刺参致病可能是多种毒力因子综合作用的结果，但不同毒力基因对毒力的贡献以及基因间的内在联系尚不明确，了解其携带毒力的情况，能更好地理解其致病性及传播性。
3.3 药敏试验结果分析
关于弧菌抗生素耐药性的研究发现，不同源、不同株的溶藻弧菌间的耐药性也不尽相同。在辽宁地区食品中分离的39株溶藻弧菌主要对β-内酰胺类和大环内酯类抗生素耐药和中介，其中对头孢唑啉耐药率高达57.5%、对氨苄西林为20.0%，对红霉素为12.5%，三重耐药菌比率达12.5%[29]。值得注意的是，溶藻弧菌是一种人和海洋动物共感染的病原菌[30]，通过对溶藻弧菌AP-1药敏检测结果分析可知，该菌已对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类以及氯霉素类中多种抗生素处于耐药或中介状态，所以在临床和水产病害防治过程中都要避免使用此类抗生素。根据《水产养殖用药明白纸2020年1、2号》中已批准的水产养殖用兽药，建议优先考虑恩诺沙星、氟苯尼考、多西环素以及复方新诺明等抗生素用于防治仿刺参弧菌感染。虽然抗生素能够高效治疗疾病，但也导致了诸多问题，如海产品中药物残留、细菌耐药性增加、水产养殖环境中微生物种群的破坏以及水生动物免疫系统的抑制等，且农业农村部第194号公告发布，自2020年起饲料中全面禁止添加抗生素。因此，开发高效、绿色及安全的抗生素替代品，如中草药制剂、微生态制剂、卵黄抗体及噬菌体等，有望为由弧菌引起的刺参腐皮综合征的防控及治疗提供新思路。
研究表明，此次大连地区发生的刺参腐皮综合征的病原菌为溶藻弧菌，该菌具有较强的致病性。为避免此类病害再次发生：一方面，在养殖过程中应注重水质净化及养殖密度，避免因操作不当造成仿刺参生物体损伤；
另一方面，必须加强对刺参腐皮综合征的病原学和流行病学的研究，开发新型抗生素替代品。这样才能更好地减少不必要的经济损失，推动仿刺参产业的发展。