丁 波，杨新军，李智敏，李雅莉
三二〇一医院儿科，陕西汉中 723000
毛细支气管炎是2岁以下婴幼儿常见的呼吸道感染性疾病，以1～6个月婴儿多发，最常见的病原体是呼吸道合胞病毒(RSV)[1]。据相关报道，1/3～1/2的毛细支气管炎患儿后期会进展为哮喘，RSV感染性毛细支气管炎患儿罹患哮喘的概率明显增加[2]。有研究发现，遗传因素是哮喘的基本病因，毛细支气管炎患者患病后3年发生哮喘的概率达54%，认为其与哮喘存在共同的遗传基础[3]。有研究表明，基因多态性与RSV感染后哮喘的发生存在相关性，提示遗传因素在毛细支气管炎的发生和发展中有重要作用[4]。既往有研究证实，位于17q21染色体的血清类黏蛋白1样蛋白质3(ORMDL3)基因多态性与儿童哮喘相关，以单核苷酸多态性(SNP)rs7216389位点为主要代表，被认为是哮喘的标志性基因[5]。基质金属蛋白酶(MMP)是一种蛋白水解酶，有研究表明其家族异常表达与哮喘患儿气道高反应和病情严重程度有关，证实MMP-9基因多态性与婴幼儿慢性炎症性疾病有关[6]。RSV感染性毛细支气管炎疾病易感性与MMP-3启动子区1171 5A/6A基因、1171 6A/6A基因多态性及MMP-9启动子区1562 C/T基因多态性有关，证实MMPs基因多态性在儿童RSV感染性毛细支气管炎的发生和发展中意义重大[7]。基于此，本研究拟探讨MMP-3、ORMDL3基因多态性与儿童RSV感染性毛细支气管炎病情严重程度及疾病易感性的关系，现报道如下。
1.1一般资料 选取2020年1月至2021年5月本院收治且诊断为RSV感染性毛细支气管炎的63例患儿作为观察组，其中男36例，女27例，平均年龄(8.2±2.4)个月。参照呼吸系统评分标准[8]进行病情评估后将观察组又分为轻度组[20例(<7分)]、中度组[30例(7～9分)]和重度组[13例(>9分)]。另选取同期配对的50例健康体检儿童作为对照组，其中男30例，女20例，平均年龄(7.9±2.3)个月，无毛细支气管炎、哮喘病史及相关家族史。两组性别、年龄比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获得本院医学伦理委员会批准，家属均知情同意并签署知情同意书。
1.2纳入和排除标准 纳入标准：毛细支气管炎诊断参考《毛细支气管炎诊断、治疗与预防专家共识(2014年版)》[9]中的标准，鼻拭子RSV抗原检测呈阳性；
年龄2～24个月，既往无哮喘病史；
临床资料完整。排除标准：支气管、肺组织发育不良，以及先天性心脏病和心血管畸形等基础疾病；
早产及双胎；
合并免疫缺陷疾病或使用免疫抑制剂、激素的患儿；
过敏性疾病家族史；
心肺等重要脏器功能不全；
合并其他慢性呼吸道疾病等。
1.3方法
1.3.1仪器与试剂 9700型聚合酶链反应(PCR)仪、3730XL DNA测序仪(美国ABI公司)；
离心机(PMC-860，美国Tomy公司)；
MassARRAY Typer系统(美国Sequenom公司)；
反转录试剂盒(美国Invitrogen公司)；
合成引物及探针[中国宝生物(大连)工程有限公司]。
1.3.2PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测MMP-3、ORMDL3基因多态性 采集所有受试者外周静脉血约3 mL，抗凝，以3 000 r/min离心10 min，取血清保存，送检；
采用DNA检测试剂盒提取DNA，采用PCR-RFLP检测MMP-3、ORMDL3基因多态性。根据Primer-Blast软件设计基因引物序列，采用Blast进行引物比对以减少非特异性扩增，见表1；
PCR反应体系：DNA模板1.0 μL，引物1.0 μL，10×Taq缓冲液2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，Taq酶0.2 μL，加ddH2O至总体积为20.0 μL；
PCR反应条件:95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，循环35次；
37 ℃对PCR产物进行酶切，采用MassARRAY Typer系统分析基因分型，操作步骤按照检测试剂盒及仪器说明书进行。
表1 MMP-3、ORMDL3基因SNP引物序列
2.1SNP基因型分布平衡检验 rs522616、rs679620、rs7216389、rs2603332基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P=0.856、0.648、0.574、0.348)，表明该样本基因频率已达到遗传平衡，具有群体代表性。
2.2MMP-3基因多态性分析
2.2.1观察组和对照组MMP-3基因rs522616、rs679620位点基因型和等位基因分布情况比较 观察组MMP-3基因rs522616位点基因型和等位基因分布情况与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；
MMP-3基因rs679620位点基因型和等位基因分布情况与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中AG基因型和A等位基因频率均明显高于对照组，GG基因型和G等位基因频率均明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。
表2 观察组和对照组MMP-3基因rs522616、rs679620位点基因型和等位基因分布情况比较[n(%)]
2.2.2轻度组、中度组和重度组MMP-3基因rs522616、rs679620位点基因型和等位基因分布情况比较 MMP-3基因rs522616位点基因型和等位基因分布情况与观察组患儿病情严重程度和疾病易感性均无明显相关性(P>0.05)；
MMP-3基因rs679620位点基因型和等位基因分布情况与观察组患儿病情严重程度和疾病易感性均明显相关(P<0.05)，重度组MMP-3基因rs679620位点AG基因型频率均明显高于轻度组和中度组，差异均有统计学意义(P<0.05)，其等位基因分布情况在不同严重程度组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
表3 轻度组、中度组和重度组MMP-3基因rs522616、rs679620位点基因型和等位基因分布情况比较[n(%)]
2.3ORMDL3基因多态性分析
2.3.1观察组和对照组ORMDL3基因rs7216389、rs2603332位点基因型和等位基因分布情况比较 观察组ORMDL3基因rs7216389位点基因型和等位基因分布情况与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中TT基因型和T等位基因频率均明显高于对照组，CT基因型和C等位基因频率均明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；
观察组ORMDL3基因rs2603332位点基因型和等位基因分布情况与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。
表4 观察组和对照组ORMDL3基因rs7216389、rs2603332位点基因型和等位基因分布情况比较[n(%)]
2.3.2轻度组、中度组和重度组ORMDL3基因rs7216389、rs2603332位点基因型和等位基因分布情况比较 ORMDL3基因rs7216389位点基因型和等位基因分布情况与疾病易感性明显相关(P<0.05)，与病情严重程度无关(P>0.05);ORMDL3基因rs2603332位点基因型和等位基因分布情况与疾病易感性和病情严重程度均无明显相关性(P>0.05)，见表5。
表5 轻度组、中度组和重度组ORMDL3基因rs7216389、rs2603332位点基因型和等位基因分布情况比较[n(%)]
毛细支气管炎作为婴幼儿常见的下呼吸道感染性疾病，据流行病学报道显示，约70%的患儿出生后1～12个月会发生RSV感染，约90%以上的2岁幼儿均感染过RSV，RSV亦是毛细支气管炎后期进展为哮喘的重要危险因素[2,10]。因此，由RSV引发的各类儿童疾病目前仍是公共卫生领域研究的重点方向。基因多态性是指同一个生物群体中存在两种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因[8]。随着对基因遗传学的深入研究，人们逐渐意识到疾病易感性及病情严重程度与基因遗传多态性关系密切，发现多个RSV感染性毛细支气管炎遗传易感标记，如编码白细胞介素(IL)-4、IL-8和表面活性蛋白的基因、白三烯C4等[11]，这表明人类基因多态性在阐明人体对疾病易感性、疾病临床表现的多样性及遗传性疾病的分子机制中有重大意义，与致病基因连锁的多态性位点可作为遗传病的诊断标记。毛细支气管炎后继发哮喘具有家族聚集性，RSV感染性毛细支气管炎与哮喘具有共同的遗传易感性[3]。近年来，基因多态性与临床表型多样性的联系逐渐受到广泛关注，因此,积极探讨基因SNP与毛细支气管炎易感性及病情严重程度的相关性有重要意义。
人类遗传过程中SNP是一种常见的形式，DNA序列多态性可引起个体对病原菌感染的易感性发生差异[12]。MMPs是一种蛋白水解酶，目前已知的有1～28号，主要对细胞外基质起降解和调节其动态平衡的作用，对转录水平中的表达调控作用至关重要[13]。MMP-3是MMPs家族的关键酶，目前有关其基因多态性的研究主要以2号外显子rs679620位点、5′端转录调控区rs522616位点及启动子区1171 5A/6A位点为主，发现MMP-3基因上的SNP rs522616和rs679620位点的基因型和等位基因的改变可能会导致不同人群MMPs活性及表达不同，导致某些疾病在不同人群中的严重性及易感性存在差异，证实MMP-3基因多态性在肺部疾病的发生和发展中起重要作用。在RSV感染性疾病的研究中，HIRAKAWA等[14]在RSV感染的人鼻黏膜上皮细胞中证实RSV感染会促进MMP-3表达。SCHUURHOF等[15]研究发现，RSV感染性毛细支气管炎患儿rs522616位点等位基因A频率明显升高，提示其多态性与RSV感染密切相关，该位点等位基因A可能通过促进MMP-3表达，引起MMP-3及其组织抑制剂表达失衡，加重肺组织损伤，进而造成RSV感染。吴用等[7]报道显示，MMP-3的1171 5A/6A基因和1171 6A/6A基因多态性与RSV感染性毛细支气管炎易感性相关。本研究通过对MMP-3基因上的rs679620、rs522616位点检测发现，观察组患儿MMP-3基因rs679620位点AG基因型和A等位基因频率均明显高于对照组，且重度组AG基因型频率均明显高于轻度组和中度组，表明MMP-3基因rs679620位点多态性与RSV感染性毛细支气管炎疾病易感性和病情严重程度均明显相关，携带AG基因型和A等位基因的患儿更易发病且病情较重；
MMP-3基因rs522616位点基因型和等位基因分布在不同组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，但并不表明其多态性对RSV感染性毛细支气管炎的发生和发展无明显影响。鉴于RSV感染性毛细支气管炎病理机制复杂，本研究纳入部分样本进行分析，MMP-3基因rs522616位点基因表达不可避免可能受其他未知多因素的影响，还需进一步深入探讨。
ORMDL3基因能够通过改变内质网Ca2+浓度，促进非折叠蛋白反应，是内在的炎症通路[16]。有研究证实，ORMDL3基因SNP与儿童哮喘关系密切，发现其rs7216389位点碱基C→T的改变可影响ORMDL3表达，而rs4794820位点参与气道高反应性调节及上皮细胞炎症，在哮喘发病中作用明显[5]。王玲等[17]研究报道显示，ORMDL3上的rs7216389 C等位基因是哮喘的保护基因，T等位基因是哮喘的易感基因。刘丽红等[18]研究发现，哮喘患者SNP rs7216389位点TT基因型和T等位基因频率均明显高于健康人群，是哮喘发病的高危基因型。胡慧婷等[19]研究发现，GSDMB/ORMDL3基因上的rs4794820位点AA基因型和rs7216389位点CC基因型降低了哮喘的发病风险，rs4794820位点GG基因型和rs7216389位点TT基因型则提高了哮喘的发病风险。本研究分析了ORMDL3基因的SNP rs7216389和rs2603332位点与RSV感染性毛细支气管炎的关系显示，观察组患儿ORMDL3基因rs7216389位点TT基因型和T等位基因频率均明显高于对照组，但与病情严重程度无明显相关性，提示ORMDL3基因rs7216389位点是哮喘与毛细支气管炎易感性的共同遗传基因，TT基因型是二者发病的高危基因型；
ORMDL3基因rs2603332位点基因型和等位基因分布与RSV感染性毛细支气管炎疾病易感性和病情严重程度均无相关性，证实ORMDL3基因多态性仅与毛细支气管炎易感性有关，与病情严重程度无明显相关性。本研究结果表明，MMP-3、ORMDL3基因多态性与RSV感染性毛细支气管炎发病关系密切，对其SNP位点的研究有助于评估毛细支气管炎患儿对RSV的疾病易感性和病情严重程度，也可为毛细支气管炎的预防和治疗提供更多分子标志物，具有积极的临床意义。此外，基因的SNP位点一般具有多个，本研究分别选取了与哮喘相关性较强的2个SNP位点，并探讨其与RSV感染性毛细支气管炎的关系，故对于MMP-3、ORMDL3基因多态性与RSV感染性毛细支气管炎发生和发展的关系还需从不同角度继续进行探讨。
MMP-3基因rs679620位点多态性及AG基因型与疾病易感性和病情严重程度均有关；
ORMDL3基因rs7216389位点多态性与疾病易感性有关。MMP-3、ORMDL3基因多态性检测对儿童RSV感染性毛细支气管炎疾病易感性和病情严重程度评估具有临床指导意义。