张喜武，张 利，王雅泓，李梦聪，胡志欣，王璐璇，王 锐，窦金金
（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；
2.哈尔滨成程生命与物质研究所，黑龙江 哈尔滨 150500；
3.黑龙江中医药大学第一附属医院，黑龙江 哈尔滨 150040）
骨质疏松症（OP）属常见慢性骨疾病，是以骨代谢紊乱、微结构损坏、骨量流失、骨密度和钙（Ca）水平降低为特点，易发生脆性骨折的全身骨代谢疾病［1-4］。30岁以后机体内骨量约以1%的幅度逐年递减，人们在生活中不良的生活习惯，如酗酒、吸烟、运动量不足等均会造成骨质流失，导致继发性OP，同时疾病、药物等多个因素也易导致OP［5］。人参为五加科植物人参Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根茎，味甘，性温，是我国传统的滋补养生名贵药材。人参主补五脏，现代药理学研究证实，可随机体机能状态的不同发挥双向作用，即适应原样作用，同时也证实人参皂苷类成分对OP有潜在的防治作用。人参皂苷Rb1通过上调RUNX2蛋白表达、调节Wnt/β-catenin信号通路、护骨素（OPG）、核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的表达和抑制P21和P27mRNA的表达来促进成骨分化［6-7］。人参碳量子点溶胶液（简称人参根饮液）是以人参为原料，采用超音速对撞粉碎和光电碳化技术，使其碳化集聚负载大量电荷［8］而成的溶液。本研究中拟探讨人参根饮液对模型鼠骨质疏松的改善作用。现报道如下。
1.1 仪器、试药与动物
仪器：AL204型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；
Synergy H1型酶标仪（美国BioTek公司）；
TGL-16C型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；
OSTEOCORE型双能X光骨密度仪（法国DMS公司）；
生物碳原子团簇活化装置（黑龙江沃生控股有限公司）；
ASP300S型脱水机、HI1210型摊片机、RM2255型切片机、EG1150H型包埋机（德国Leica公司）；
Nikon E600W型荧光显微镜（日本Nikon公司）；
RT-9200型半自动生化分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）。
试药：人参根饮液（哈尔滨团簇现代中医健康服务有限公司，批号201811190802，规格每瓶95 mL）；
维A酸（上海麦克林生化科技有限公司，批号为C12056221）；
水合氯醛（天津市凯通化学试剂有限公司，批号为20201109）；
4%多聚甲醛（批号为0104A21），脱钙液（批号为0104A21），均购自北京雷根生物技术有限公司；
小鼠血清骨钙素（BGP）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（批号为E20210105A），小鼠碱性磷酸酶（ALP）ELISA试剂盒（批号为E20201217A），均购自美国R&D公司。
动物：SPF级KM小鼠50只，雌性，体质量（20±2）g；
SD大鼠40只，雄性，体质量（200±20）g，均购自黑龙江中医药大学药物安全评价中心，动物生产合格证号SCXK（黑）2018-003。实验期间所有动物分笼饲养在室温恒定、相对湿度适度、通风良好的清洁环境中，饲养条件均一致，自由饮用水，以专用鼠粮喂养，每周更换垫料2次，均于饲养室适应性喂养1周。
1.2 方法
1.2.1 分组、建模及给药
将50只小鼠随机分为空白对照组（等体积纯净水），模型组（等体积纯净水），人参根饮液高、低剂量组（9.88 mL/kg和4.94 mL/kg），人参根饮液预防1组（4.94 mL/kg）［8］，各10只。灌胃维A酸70 mg/kg，每天1次，连续14 d以复制骨质疏松小鼠模型。建模成功后前4组灌胃相应药物或纯净水，每天1次，连续28 d；
人参根饮液预防1组灌胃相应药物，每天1次，连续28 d后灌胃维A酸70 mg/kg，每天1次，连续14 d，同时灌胃相应药物。
将40只大鼠随机分为空白对照组（等体积纯净水）、模型组（等体积纯净水）、人参根饮液组（6.62 mL/kg）、人参根饮液预防2组（3.31 mL/kg）［8］，各10只。灌胃维A酸70 mg/kg，1 d 1次，连续14 d以复制骨质疏松大鼠模型［9］。建模成功后前3组灌胃相应药物或纯净水，1 d 1次，连续28 d。人参根饮液预防2组灌胃相应药物，1 d 1次，共42 d，连续28 d后灌胃维A酸46 mg/kg，每天1次，连续14 d。
1.2.2 观察指标
一般情况：观察各组小鼠食少、竖毛、喜卧、体质量减轻等表现［10］。
血清学指标：于末次给药24 h后，小鼠摘眼球取血，室温下静置2 h，以离心半径6 cm、3 000 r/min离心15 min，吸取上清液，以半自动生化仪检测血清Ca、磷（P）水平，酶标仪检测ALP和BGP水平，参照试剂盒说明书操作。
脏器指数：称定小鼠体质量，于取血后解剖取其脾、胸腺、子宫，称定质量，并计算脏器指数。脏器指数=脏器质量（g）/体质量（g）×1 000。
骨组织形态学：于小鼠取血后，取其左侧股骨，以生理盐水清洗，置4%多聚甲醛中固定；
常温下进行乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙液脱钙，每日检查股骨的脱钙情况，以针头能插入股骨表面为脱钙成功。将脱钙后的股骨取出，流水过夜冲洗，脱水，石蜡包埋，切片（厚度6 μm），苏木素-伊红（HE）染色，切片，显微镜下观察骨组织形态并拍照。
骨密度：于末次给药后，大鼠腹腔注射水合氯醛（35 mg/kg），以骨密度仪测定大鼠股骨的骨密度值。
1.3 统计学处理
2.1 小鼠一般情况
人参根饮液高剂量组、预防1组各死亡1只小鼠。空白对照组小鼠精神状态良好，日常活泼好动，饮食正常；
模型组小鼠精神状态较差，皮毛粗糙，喜卧，饮食减少。与模型组比较，人参根饮液高、低剂量组和预防1组小鼠精神状态良好，皮毛较光滑，活动较灵敏。小鼠体质量变化见图1。
图1 小鼠体质量变化曲线Fig.1 Change profiles of body mass of mice
2.2 小鼠脏器指数
与空白对照组比较，模型组小鼠脾指数显著升高，胸腺指数显著降低（P＜0.01）；
与模型组比较，人参根饮液高剂量组小鼠脾指数显著降低，人参根饮液高、低剂量组和预防1组胸腺指数均显著升高（P＜0.05）。与空白对照组比较，模型组小鼠子宫指数降低；
与模型组比较，各给药组小鼠子宫指数升高，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。详见图2。
图2 小鼠胸腺、脾、子宫指数的影响Note：Compared with those in the blank control group，#P＜0.05，##P＜0.01；
Compared with those in the model group，*P＜0.05，**P＜0.01（for Fig.2 and 4，Tab.1）.Fig.2 Indexes of thymus，spleen and uterus of mice
2.3 小鼠股骨组织形态学
横切面：空白对照组小鼠股骨成骨细胞完整；
模型组小鼠股骨成骨细胞凋亡，不完整且间隙较大；
与模型组比较，人参根饮液高、低剂量组和预防1组小鼠股骨成骨细胞完整，间隙小。详见图3。
图3 小鼠股骨组织切片（HE，×400）A.Transverse section B.Longitudinal section a1，a2.Blank control group b1，b2.Model group c1，c2.GRD high-dose group d1，d2.GRD low-dose group e1，e2.GRD prevention groupⅠFig.3 Femoral tissue sections of mice（HE，×400）
纵切面：空白对照组小鼠股骨骨小梁排列有序、致密，骨小梁饱满，骨髓腔隙较小，形态结构较完整；
模型组小鼠股骨骨小梁结构遭到破坏，连续性差，出现断裂结构，骨髓腔增大变多；
与模型组比较，人参根饮液高、低剂量组和预防1组小鼠股骨骨小梁排列有序、致密、饱满、连续性好，骨髓腔较小，形态结构较完整。详见图3。
2.4 小鼠血清学指标
与空白对照组比较，模型组小鼠血清ALP和BGP，及P水平均显著升高，Ca水平显著降低（P＜0.01或P＜0.05）；
与模型组比较，人参根饮液高、低剂量组和预防1组小鼠血清ALP和BGP及P水平均显著降低，Ca水平显著升高（P＜0.01或P＜0.05）。详见表1。
表1 各组小鼠血清ALP，BGP，Ca，P水平比较（±s）Tab.1 Comparison of serum ALP，BGP，Ca，P levels of mice in each group（±s）
表1 各组小鼠血清ALP，BGP，Ca，P水平比较（±s）Tab.1 Comparison of serum ALP，BGP，Ca，P levels of mice in each group（±s）
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2.5 大鼠股骨骨密度
与空白对照组比较，模型组大鼠骨密度值显著降低（P＜0.01）；
与模型组比较，人参根饮液组和人参根饮液预防2组骨密度值均显著升高（P＜0.01）。详见图4。
图4 大鼠股骨骨密度Fig.4 BMD of rats
人参含多糖类、皂苷类等有效成分，人参皂苷Rb1中的二醇类物质能调节模型大鼠体内骨形成蛋白、Smad1和ALP水平，并且能促进骨骼的形成及成骨细胞和破骨细胞的增殖与分化［11-13］。人参皂苷Rh2可预防老年大鼠骨量流失［14］，故人参皂苷Rb1及Rh2有可能是人参根饮液防治OP的潜在有效成分。本课题组前期研究发现，有效成分制备成碳量子后，能富集在2～10 nm的碳骨架内或者表面，具有骨细胞靶向吸收的作用，这也有可能是人参根饮液防治OP的原因之一。
维A酸为维生素A的衍生物，作为诱导性药物，可影响骨的正常代谢、生长和发育，最终导致骨质疏松的发生［15-17］。维A酸复制模型具有特点明确、易操作、周期短等优点［18］。本研究中共选用7个评价指标，确保模型复制的准确性和药效学研究的真实性，骨密度作为诊断OP的金标准，是临床和科研最常用的方法［19］，增加骨密度可有效降低骨质疏松骨折的发生率［9］。本研究结果显示，与模型组比较，人参根饮液组和预防组大鼠骨密度值均显著升高，表明人参根饮液对模型鼠骨质疏松有较好的改善与预防作用。骨的病理形态学是反映骨质疏松的病理组织状况的客观指标。维A酸诱导骨质疏松小鼠模型复制成功后，骨重建速度加快，骨质丢失严重，骨小梁变薄，连接性中断、间隙变大。本研究结果显示，人参根饮液组小鼠骨小梁明显增粗，排列尚整齐并连接成网，部分区域骨小梁间隙略增大，说明人参根饮液可通过改善或修复骨组织的形态结构来改善骨质疏松。
维A酸可破坏卵巢功能，降低雌激素水平，致使子宫指数降低［20］。本研究中，模型组小鼠子宫指数低于空白对照组，人参根饮液高、低剂量和预防1组小鼠子宫指数高于模型组，但差异均无统计学意义。有文献报道，给药周期超过3个月，子宫指数才会有明显变化［21］，而本研究中给药周期过短。
综上所述，人参根饮液对骨质疏松模型鼠骨密度有积极影响，同时也对骨组织形态结构具有改善作用。该研究结果为人参根饮液预防骨质疏松的机制提供了理论依据。
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