孙卫民，李淑兰，谢建军
（河北省三河燕郊福合第一医院外科，河北 三河 065201）
Wnt 信号通路是一个复杂的蛋白质作用网络，在生物进化中极为保守，通过多环节、多作用位点调控生物体正常的生长发育。Wnt 通路与其他细胞信号通路间互相交叉，构成复杂的调控体系，并与肿瘤的发生和生长有关。Wnt 蛋白在功能上通常分为典型和非典型Wnt 配体两类，分别激活典型和非典型Wntβ-连环蛋白信号级联，调节细胞增殖、迁移、分化和极性过程[1]。本文阐述了非典型Wnt 配体——Wnt5a 在结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）发病中的分子机制和临床意义。
在典型Wntβ- 连环蛋白信号通路中，靶基因的表达受Wnt 配体存在和缺失的影响。生理条件下，当Wnt 配体与跨膜受体卷曲蛋白（frizzelds，Fzd）的胞外区结合后，β- 连环蛋白转位进入细胞核，与特定的转录因子如T 细胞因子/ 淋巴样增强结合因子紧密结合，刺激参与细胞增殖和分化的靶基因表达[2]。当Wnt 配体缺乏时，β- 连环蛋白被降解，主要复合物成分包括糖原合成酶激酶3β、腺瘤样结肠息肉易感基因蛋白和轴蛋白被破坏并泛素化，影响细胞信号通路的转导[1]。与典型Wntβ- 连环蛋白信号相反，非典型Wnt 信号可独立于β- 连环蛋白，通过激活Wnt/Ca2+和平面细胞极性（planar cell polarity，PCP）通路，调节Wnt 非典型配体的表达和其他细胞的代谢过程。其中，Wnt5a 是一种研究较多的非典型Wnt 配体。研究发现，随着Wnt 非典型配体与Fzd 受体结合并激活散乱蛋白，PCP 信号通路被触发，通路的其他细胞内介质，包括Rho、Rac、Rho 相关激酶和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）也分别被激活。激活后的PCP 信号通路在调节肌动蛋白聚合和肌凝蛋白活化中起关键作用[3]。与PCP 通路相反，Wnt/Ca2+信号通路也可由Wnt5a 和Ror2 受体之间的相互作用而触发，导致磷脂酶C 诱导产生肌醇1,4,5三磷酸和1,2 二酰基甘油，形成膜结合4,5- 二磷酸。随后，活化的肌醇1,4,5 三磷酸促使内质网释放Ca2+，激活多种转录因子，包括钙/ 钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ诱导的核因子-κB 和蛋白磷酸酶、钙调磷酸酶诱导的T 细胞相关核因子，在调节细胞黏附、细胞骨架更新、迁移和组织细胞分离方面发挥重要作用[4]。Wnt5a 通过靶向肿瘤细胞中广泛存在的多种病理过程，包括细胞衰老、化疗耐受、肿瘤细胞微环境、肿瘤相关炎症反应、上皮间质转化、细胞增殖、细胞侵袭和迁移等，介导抑癌和致癌作用。Wnt5a 的表达水平决定了其在特定肿瘤分型中作为抑癌基因或致癌基因的功能。Wnt5a 也是一种自分泌和旁分泌分子，在不同肿瘤分型中，刺激相关的致癌和抑癌信号[3]。
Wnt5a 的致癌作用，可能通过特定细胞介导而影响CRC 肿瘤细胞的代谢过程，包括肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）。TAMs诱导Wnt5a 表达后，刺激肿瘤细胞增殖和CRC 的HCT116 和DLD1 细胞迁移，并强化巨噬细胞浸润。Wnt5a 对TAMs 的自分泌作用也是促进CRC 肿瘤细胞生长的重要途径。wnt5a 自分泌刺激TAMs-M2 极化，作为TAM 亚型，引发细胞增殖、迁移和CRC的HCT116 和DLD1 细胞侵袭，使TAMs 分泌白细胞介素-10 明显增加。由于Wnt5a 在CRC 细胞中的表达水平较高，故该配体可逐步影响肿瘤细胞的增殖、分化、迁移和侵袭等不同细胞过程[5]。在可诱导的Wnt5a 转基因小鼠模型中，也观察到Wnt5a 可刺激CRC 细胞的定向迁移和侵袭[1]。Wnt5a 非典型信号通路的下游作用靶点是钙/ 钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱγ，后者可作为肿瘤微环境中肠上皮细胞高表达的调节因子。在右旋糖酐硫酸酯钠诱导的结肠炎相关癌中，通过过表达Wnt5a 以及Wnt5a 受体和Wnt5a 辅受体Fzd-2、-5 和Ror2，促进了炎症信号的传递并导致肠上皮细胞损伤。肠上皮细胞过表达Wnt5a 及其受体/ 辅受体后，Wnt5a 显著增加了蛋白激酶Ⅱγ 的磷酸化，在结肠炎相关癌发病的过程中，过度激活上皮信号转导器和转录激活因子-3 信号，最终影响结肠上皮细胞的存活和增殖[6]。
其他细胞信号作用通路也影响Wnt5a 的致癌作用。瞬时受体电位通道家族成员TrpC5 在CRC 细胞中呈高表达，在调控结肠肿瘤细胞分化中发挥重要作用。与肿瘤微环境区调控分泌因子一致，TrpC5 可激活非选择性可渗透Ca2+通道。研究表明，表达TrpC5的低分化CRC 细胞株SW480、HT-29、SW620、DLD1、HCE8693 和RKO 可上调Wnt5a 和细胞质β- 连环蛋白表达，最终导致CRC 细胞分化减少及干细胞化增强[7]。而β- 连环蛋白能促进许多原癌基因的表达，是许多原癌基因的产物，受多种调节因子的影响。细胞内β- 连环蛋白丰度、分布以及功能的变化，可影响生物的胚胎发育、能量代谢等系列生理过程，甚至会导致肿瘤的发生及恶化等事件[2]。因此，Wnt5a的致癌作用与β- 连环蛋白密切相关。Wnt5a 的另一种调控因子是叉头盒转录因子M1（forkhead box transcription factor M1，FOXM1），它是一种与细胞增殖相关的转录因子，通过调节肿瘤微环境树突状细胞中靶基因的表达，在肿瘤的发生中发挥重要作用。在骨髓来源树突状细胞中，通过增加H3 赖氨酸79 的去甲基化，使FOXM1 活化后激活Wnt5a 非典型信号通路，抑制树突状细胞形成正常的细胞表型和功能。Wnt5a 也能通过降低FOXM1 启动子去甲基化，抑制树突状细胞成熟表型的形成，影响肿瘤细胞的增殖和分化[8]。
Wnt5a 作为CRC 的肿瘤抑制因子也是通过多通道、多模式的相互交叉作用实现的。表观遗传修饰诱导调控Wnt5a 的表达水平，可能是决定Wnt5a 在CRC 细胞中具有肿瘤抑制作用的途径之一[9]。在CRC的不同发展阶段，Wnt5a 的表观遗传可能发生动态改变。Wnt5a 异常的甲基化水平与CRC 的临床病理特征有关，包括最大肿瘤直径、肿瘤侵袭范围、肿瘤部位、组织学分型等[1]。在异位模型中诱导Wnt5a 过表达，可抑制上皮- 间质转化、典型Wnt 通路以及HCT116 细胞株中Wnt/Ca2+信号的过度激活，进一步强化了Wnt5a 对原发性结肠癌的肿瘤抑制作用。研究表明，CRC 细胞中甲基化诱导的Wnt5a 沉默，通过下调β- 连环蛋白水平和Wntb- 连环蛋白信号失活，可抑制肿瘤细胞的克隆性[10]。Wnt5a 甲基化水平与微卫星不稳定性等肿瘤特征显著增加相关联，包括存在错配修复蛋白、MLH1 甲基化、近端病变、黏液类型、女性患者等[8]。此外，甲基化引起CRC 细胞中Wnt5a表达水平降低，与化疗药物5- 氟尿嘧啶（5-FU）的肿瘤抑制作用呈负相关。而由Wnt5a 异常甲基化诱导的Wnt5a 表达缺失与淋巴结浸润和TNM 晚期分型显著相关，提示Wnt5a 在CRC 患者中起抑癌基因的作用。
研究发现，siRNA 诱导敲除Wnt5a 的低甲基化LoVo 和SW480 细胞后，5-FU 的抗肿瘤效果强于过表达Wnt5a 的高甲基化HCT116 和SW620 细胞，提示Wnt5a 表达缺失可降低5-FU 对CRC 细胞的抑制作用[10]。在CRC 患者中，Wnt5a 甲基化水平受维生素D 摄入量的影响，维生素D 可使Wnt5a 甲基化水平降低以抑制细胞增殖，通过减少维生素D 的摄入可提升Wnt5a 的高甲基化水平[7]。由于SW480 细胞株中Wnt5a 的甲基化水平通常会降低，在转化生长因子-β 处理的SW480 细胞中，通过激活增强子zeste 同源物2 诱导Wnt5a 启动子H3K27 的高甲基化，从而可降低Wnt5a 的表达水平[11]。另外，CRC细胞启动子区域组蛋白修饰可引起Wnt5a 表达缺失，给予组蛋白去乙酰化酶抑制剂，包括曲古菌素A 和丁酸钠后，与无转移的人CRC 细胞株SW480 相比，高转移人CRC 细胞株SW620 通过增加其启动子区H3Ac、H4Ac 和H3K4me2 组蛋白乙酰化水平，增加了Wnt5a mRNA 和蛋白的表达水平[12]。采用重组Wnt5a（rWnt5a）或Wnt5a 模拟肽Foxy-5 处理CRC细胞系HT-29 和Caco-2，在前列腺素E2分解代谢中，通过促进抑癌酶15-羟基前列腺素脱氢酶（15-PGDH）的过表达和Wntβ- 连环蛋白信号的减少，能抑制细胞增殖和促进细胞分化[13]。利用结肠细胞外钙敏感受体刺激HT-29 细胞的Wnt5a 表达，通过诱导Ror2和缺失同源物2 过表达，以及Wntβ- 连环蛋白信号失活，可抑制细胞增殖。将脂多糖加入到RAW264.7小鼠巨噬细胞或HT-29 细胞中，可刺激肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达，使Wnt5a 的表达水平显著增加，导致HT29 CRC 细胞系中TNF 受体1 激活，通过过表达Ror2 调控Wnt3a 典型信号通路[14]。多项研究均发现了Wnt5a 的肿瘤抑制作用。在CRC 的不同肿瘤细胞中，Wnt5a 的表达水平不是固定不变的，多种介质的调控共同决定了Wnt5a 肿瘤抑制作用功能的实现。Wnt5a 对CRC 不同组织细胞类型和肿瘤组织的抑制作用表明，该蛋白可能成为抑制CRC 进展的关键治疗靶点。Wnt5a 表达缺失也与CRC 不同阶段的临床病理特征之间存在关联。与组蛋白修饰诱导的Wnt5a 高甲基化一致，Wnt5a 表达水平下调与Ⅲ、Ⅳ期CRC 以及CRC 组织的淋巴结浸润程度呈正相关。Wnt5a 低表达与CRC 患者年龄、性别、肿瘤大小、组织学分化和复发无关，而与转移性组总生存率显著降低有关[15]。提示通过检测Wnt5a 甲基化水平可能对CRC 不同肿瘤亚型患者的预后做出预判。
综上所述，Wnt5a 在CRC 不同阶段的致癌和抑癌作用表明，Wnt5a 与其他细胞通路相互交叉，对CRC 细胞的增殖、分化产生影响。Wnt5a 在CRC 发病机制中的重要性，可能成为有临床价值的候选靶点。未来需要对Wnt5a 特异性拮抗剂作为CRC 新的治疗策略进行相关研究，以探索CRC 基于Wnt5a 分子靶向治疗的可行性。
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