吴亚姗，杨平贵，付华龙，阿龙呷，陈明华，毛进彬，庞 倩，周明亮*
（1.四川省农产品质量安全中心，四川 成都 610041；
2.四川省草原科学研究院，四川 成都 611731；
3.四川省甘孜州畜牧站，四川 康定 626000）
玛格绵羊是分布于四川省甘孜藏族自治州得荣县玛格山一带的肉毛兼用型绵羊，是近年来在四川藏区挖掘出的一种小型绵羊。该绵羊群体体格较小，结构紧凑，体躯呈圆桶状；
头大小适中，颈短；
胸宽和胸深适度，背腰平直，体躯匀称；
尾短小，呈圆锥形；
蹄质坚实；
公羊睾丸发育良好，大小适中，母羊乳房匀称，柔软而有弹性；
公、母羊头、颈、耳部毛色为黑色，其余部位为白色，少部分个体四肢有黑色斑点。公、母羊多为无角，公羊无角个体占72.4%，母羊无角个体占77.0%；
有角的个体角小，呈黑色，公羊角略粗大，母羊角细而短。
微卫星标记（Microsatellite）是由2～6 bp的小片段组成核心序列，重复10～20 次的简单序列，广泛分布于生物体整个基因组，平均每10 kb 就会出现一个。因其在基因组分布广、数量多、多态性丰富、易于检测、呈共显性遗传、所受选择压力小等优点，被用于绵羊或山羊群体的遗传多样性评价、亲子鉴定、遗传连锁图谱构建及QTL 定位等研究领域［1-3］。本次试验选择分布于绵羊26条常染色体和X染色体上的30个微卫星标记，采用毛细管电泳技术进行微卫星标记的等位基因分型，探讨玛格绵羊这一资源群体的遗传杂合性和遗传多样性，以期为该资源群体的遗传多样性评价和遗传背景研究提供依据。
1.1 血液样品 试验羊只来源于玛格绵羊的主产区得荣县玛格山一带。采用颈静脉采血的方法采集3～4 mL血液样品，注入真空采血管（含抗凝剂EDTA·K2）中，颠倒混匀，低温保存运回实验室，-20 ℃长期保存，备用。
1.2 DNA提取 采用天根生化科技（北京）有限公司生产的TIANamp Genomic DNA Kit 进行DNA 提取，按操作说明书提取基因组总DNA，提取的基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳检查合格后，置于-20 ℃保存，备用。
1.3 微卫星标记的引物 联合国粮农组织（FAO）和国际动物遗传学（ISAG）联合推荐用于绵羊群体遗传多样性分析的的微卫星标记以及从美国肉畜中心（USDA-MARC）微卫星标记数据库中筛选的标记，共30 个微卫星标记，经NCBI数据库验证引物序列的准确性。用5′-ROX、5′6-FAM（FITC）、5′-TAMRA 和5′-HEX 进行荧光标记。引物合成及荧光标记均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
1.4 PCR 扩增及等位基因分型 PCR 扩增体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，10 mmol∕L上下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL，用超纯水补充至25 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；
94 ℃变性30 s，56～63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环；
最后72 ℃延伸8 min，扩增产物于8 ℃保存。PCR 扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行等位基因分型。
1.5 数据的统计分析 用Cervus3.0 软件分析微卫星标记的等位基因数（Na）、等位基因（Allele）、等位基因频率（Allelefrequency）、多态信息含量（PIC）、观察杂合度（Ho）和期望杂合度（He）等。使用Popgen32 软件分析有效等位基因数（Ne）、Shannon 指数（I）、近交系数（Fis）和Hard-Weinberg（哈温）平衡（HWE）。
2.1 DNA提取及等位基因分型 采集玛格绵羊60 个个体的血液样品，提取DNA 采用1.5%凝胶电泳检测，结果条带清晰，可用于后期PCR 扩增试验。扩增的PCR 产物用毛细管凝胶电泳进行等位基因分型及统计分析。
2.2 等位基因及其频率 玛格绵羊群体的30个微卫星标记共有251 个等位基因，每个标记的等位基因数为4～14个，平均为8.37个等位基因，等位基因的碱基变化为76～280 bp，见表1。每个标记都有自己的主效等位基因，一般为2～4 个，但OARHH35 标记只有一个主效等位基因，其119 bp等位基因的频率达到0.775 0，而OARHH47和OarVH72标记的主效等位基因数达到6个。
表1 30个微卫星标记的等位基因及其频率
2.3 玛格绵羊群体的多样性分析 采用Cervus3.0 和Popgen32 软件分析玛格绵羊群体的有效等位基因数、观察杂合度、期望杂合度、多态信息含量、Shannon 指数、Fis 和Hard-Weinberg 平衡，结果见表2。30 个微卫星标记的有效等位基因数在1.494 1～9.045 2 之间，平均为4.013 3；
观察杂合度在0.217～0.850之间，平均为0.605 5；
期望杂合度在0.333～0.897之间，平均为0.701 8。
表2 玛格绵羊30个微卫星标记的多态性
玛格绵羊群体的PIC 在0.310～0.879 之间，平均为0.664。根据Botstein等［4］提出的衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标，OARHH35、OarAE129、MAF33、OarCP38和AGLA29 5个微卫星标记的PIC 范围为：0.5＞PIC≥0.25，属于中度多态信息含量；
BM6506、BM1824 和OarFCB128等26个微卫星标记的PIC≥0.50，属于高度多态信息含量，该群体的平均PIC 含量为高度多态信息含量，揭示该群体具有丰富的遗传多样性。
BM6506、OARHH35、OarAE129、MAF33、OarCP38 和AGLA29 6 个标记的Shannon 指数小于1，而其他24 个标记均大于1，平均为1.644 6，群体在0.689 3～2.333 2 之间；
标记BM6506 的群体内近交系数（Fis）最高，达到了最高（为0.630 4），标记HEL10 的Fis 最低（为-0.061 5），平均为0.129 2，群体内存在弱近交；
30个标记中有6个标记极显著偏离哈温平衡（HWE），1 个标记显著偏离哈温平衡，23个标记处于哈温平衡之中。
杂合度（H）又称基因多样性，反映群体在多个位点上的遗传变异情况，是被检测遗传标记多态性的度量单位，一般认为一个群体的杂合度大于0.5，意味着该群体没有受到高强度的选择，遗传多样性比较丰富。本试验中玛格绵羊群体的30个微卫星标记的观察杂合度为0.217～0.850，有BM6506、BM1824、OARHH35、OarAE129、LSTS5、OarCP38 和BMS631 这7 个标记的观察杂合度小于0.5，在这些标记位点存在较强的选择，有24个标记在0.5～1.0 之间，群体的平均观察杂合度为0.6055；
群体的期望杂合度为0.333～0.897，OARHH35、OarAE129 和OarCP38 这3 个标记的期望杂合度低于0.5，群体的平均期望杂合度为0.701 8，表明玛格绵羊群体具有较高的多样性。
PIC 是群体内遗传变异的量度指标，可用来描述微卫星位点的变异程度，我国绵羊的遗传多样性分析运用微卫星标记，统计其PIC 来评价群体的多样性，总体而言，我国绵羊群体的多样性比较丰富。赵冰茹等［5］选用9个微卫星标记探讨了新疆4 个地方绵羊群体的遗传多样性，得出巴音布鲁克羊、巴尔楚克羊、柯尔克孜羊和多浪羊群体的PIC含量分别为0.73、0.66、0.72和0.71，揭示新疆地方绵羊群体具有丰富的多样性；
王秀蓉等［6］采用微卫星标记分析了青海高原型西藏羊4个群体的多样性，其群体PIC 含量分别为0.60、0.66、0.66和0.68。
从玛格绵羊群体30 个微卫星标记中共检测到251个等位基因，每个标记的等位基因数为4～14 个，平均8.37 个，有效等位基因数在1.494 1～9.045 2 之间，平 均 为4.013 3；
Shannon 指数 在0.689 3～2.333 2之间，平均为1.644 6；
7个标记显著或极显著偏离哈温平衡，23个标记处于哈温平衡；
观察杂合度在0.217～0.850 之间，平均为0.605 5，期望杂合度在0.333～0.897之间，平均为0.701 8；
PIC 在0.310～0.879 之间，平均为0.664。本研究揭示了玛格绵羊群体的遗传多样性丰富，有进一步开发利用的价值。